利用单倍体育种技术快速培育糯性小麦新品系

该研究利用关东 10 7和白火麦为亲本做常规杂交 ,用玉米花粉对其杂种F1进行单倍体诱导 ,单倍体加倍后得到 50个DH系 ,对这些DH系进行SDS—PAGE电泳分析 ,有 6个株系是糯性小麦 ,其基因型为wx -aabbdd ;同时进行了这些DH株系种子的I2 -KI染色 ,上述 6株系种子胚乳染色均为棕红色。这 2种方法同时证明该 6个DH系为纯合糯性株系 ,说明SDS -PAGE电泳和I2 -KI染色方法鉴定糯性小麦是可靠的和准确的。该文还分析了 6个小麦株系在株高、单株穗数、千粒重及粒质地等性状上的异同。糯性小麦由于具有支链淀粉含量高、高峰粘度高和膨胀势高等特点 ,成为面条专用小麦 ;支链淀粉在轻工、医药等行业应用广泛。因此 ,糯性小麦的培育成功为小麦品质育种研究和支链淀粉的开发利用开辟了一条新途径     

我国科学家利用基因编辑技术培育出自带抗除草剂基因水稻

正近日,中国农业科学院植物保护研究所周焕斌团队提出并应用单碱基编辑技术介导的植物内源基因定向进化技术,开发出具有除草剂抗性的水稻新种质,助力农作物精准分子育种。该团队在前期开发一系列单碱基编辑器基础之上,提出了单碱基编辑技术介导的水稻内源靶标基因的定向进化技术理念,在水稻细胞内人工模拟自然界基因的长期进化过程,短时间内创制成千上万个靶基因的新等位基因材料,用于育种筛选。这项研究针对水稻除草剂基因进行引导,通过除草剂抗性筛选,成功鉴定出4个自然界中未曾被发现的、对除草剂具有不同抗性程度的新等位基因。并通过单碱基编辑技术引入到水稻生产品种南粳46中,将其升级为通过苗期一、两次施药,生育期田     

利用基因编辑技术改良水稻直链淀粉含量与香味

直链淀粉含量是稻米品质的理化指标之一,理想的稻米直链淀粉含量是13%~18%,有香味的稻米特别受消费者欢迎。本研究利用CRISPR/Cas9系统对Wx、Badh2(fgr)2个基因进行定突变,分别在Wx的5’UTR内含子剪切点和编码区序列(CDS)的第13外显子处设计靶点,Badh2的编码区序列(CDS)的第3和第9外显子处设计靶点,构建2个双靶点CRISPR/Cas9载体,通过遗传转化导入受体‘中早35’中,2个独立的转化事件分别得到14株和13株T0代转化苗,对T0突变情况分析表明,突变频率分别为57.1%,46.2%;对Wx基因编辑后产生的4个无转基因标记的T2代稳定株系进行直链淀粉含量测定,结果分别为12.2%、11.3%、7.4%、4.9%,比未编辑的对照‘中早35’(24.6%)大幅降低;同时对Badh2编辑后产生3个无转基因标记T2代稳定株系进行香气物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量测定,结果分别为228.16μg/kg,198.31μg/kg,2095.24μg/kg通过口嚼判断这3个株系确实有不同程度的香味,而没有香味的对照‘中早35’为0.000001μg/kg,以上所有株系的农艺性状与对照‘中早35’一致。综合结果表明,利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx、Badh2基因,获得了稳定遗传、较低直链淀粉含量且带有香味的突变体,为优质稻育种提供了新的种质资源和创建方法。     

利用基因拆分技术培育耐草甘膦转基因水稻的研究

耐除草剂转基因水稻基因飘流可能产生的环境安全问题是人们关注的焦点之一,并已成为耐除草剂转基因水稻能否在我国生产上发挥效益的限制因素。基因拆分技术能够有效地控制转基因目标性状飘流,为培育耐除草剂转基因水稻提供新的途径和思路。本研究将耐除草剂基因G2-aroA拆分成N端(EPSPSn,1～295aa)和C端(EPSPSc,296～435aa),分别与SspDnaE蛋白内含肽的N端(Intein-N)和C端(Intein-C)连接形成融合基因EPSPSn-In与Ic-EPSPSc,并分别通过农杆菌介导法转入受体材料中花11。Southern杂交证明转基因水稻En-12和Ec-22中外源基因为单拷贝插入。侧翼序列分析证明转基因水稻En-12和Ec-22中外源基因分别插入第2和第6染色体。利用四引物法筛选出转基因水稻En-12和Ec-22的纯合系,并通过有性杂交获得同时含有EPSPSn-In与Ic-EPSPSc的转基因水稻En×Ec。草甘膦抗性分析发现,单独含有1个基因片段的转基因水稻En-12和Ec-22不具有耐受草甘膦特性,而同时含有2个基因片段的转基因水稻En×Ec具有耐受草甘膦的特性,说明拆分后的2个蛋白片段在intein的介导下重新组装成完整有功能蛋白,并赋予转基因水稻耐受草甘膦的特性。转基因水稻En×Ec与含有完整G2-aroA转基因水稻G2-6相比,其耐受草甘膦的能力有所下降,但能够满足生产需求。本研究结果为利用基因拆分技术培育转基因耐草甘膦水稻提供了科学依据,同时也为利用基因工程手段培育转基因杂交稻提供了新的技术平台。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻温敏不育基因TMS

tms5是生产上应用最广泛的温敏不育基因。为创制新型水稻温敏核不育系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将6个优异的粳稻和4个优异的籼稻的TMS5基因敲除,获得了温敏核不育系。比较发现,粳稻温敏不育系ZG75S、CYGS、YG0618S、ZG07S、T0361S、7679S的不育起点温度在28～32°C之间,籼稻温敏核不育系2537S、6150S、6379S的不育起点温度在24～28°C之间,而籼稻温敏核不育系1109S的不育起点温度低于23.5°C。说明不同遗传背景材料获得的tms5突变体的不育起点温度不一样,通过TMS5的敲除可能获得不育起点温度较低的温敏核不育系。利用1109S与优质父本8048选配出优质高产杂交稻组合1109S/8048。大田试验表明, 1109S/8048比区试对照丰两优4号增产13.1%。温敏核不育系1109S及高产杂交稻组合1109S/8048的创制为高产育种提供了新的途径。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsMADS56基因突变体

OsMADS56是水稻中长日照下的开花抑制基因,与拟南芥中同时影响开花时间和花发育的SOC1同源。为了深入探究OsMADS56基因对水稻开花时间的调控功能,本研究利用反向遗传学的方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsMADS56基因设计了2个特异性敲除靶位点,构建了OsMADS56基因敲除载体,并通过农杆菌介导的转化方法成功获得了野生型粳稻9522背景的转基因苗。鉴定结果显示9棵OsMADS56转基因苗中包含了3种纯合突变类型,包括第一个外显子第45号碱基处缺失了一个G碱基、缺失了包含了第一个起始密码子的100个碱基对以及在第5个外显子第322号碱基处插入一个A碱基。通过蛋白序列比对分析,发现这三种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止引起保守结构域的缺失。本研究获得的水稻OsMADS56基因的三个突变体株系对今后进一步深入研究该基因的功能具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻赤霉素2氧化酶基因OsGA2ox10

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,以粳稻品种‘沈农265’为遗传背景对水稻赤霉素2氧化酶基因OsGA2ox10进行编辑,获得了该基因编码序列翻译提前终止纯合突变体ga2ox10-1、ga2ox10-2和ga2ox10-3。经RT-PCR检测突变体中OsGA2ox10基因表达量相比野生型极显著降低。表达模式分析显示该基因在根、茎、叶、叶鞘、幼穗中均有表达,其中在幼穗中表达量最高。亚细胞定位结果显示OsGA2ox10与GFP融合蛋白定位于细胞质中。本实验的开展为进一步明确GA2ox10基因功能和该基因在赤霉素代谢失活调控网络中的作用提供了依据。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsABI5突变体

在水稻种植生产上,因其种子经常发芽率不齐,导致水稻直播困难,不仅影响水稻的生产成本还影响其产量,因此水稻直播的突出问题要保持优良的种子萌发力。ABA是种子萌发的抑制因子,它通过诱导ABI5的表达来抑制种子萌发,在种子正常萌发的过程中,随着种子吸胀和GA生物合成,ABA和ABI5的含量都迅速下降,促使种子萌发。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建OsABI5突变体,以期提高种子的萌发率和萌发速度。通过农杆菌介导法将构建好的OsABI5敲除质粒转化‘日本晴’水稻的愈伤组织,经PCR和Western Blot鉴定筛选得到两株OsABI5弱表达的阳性突变株系。通过对osabi5-2突变体和‘日本晴’萌发表型的观察,发现osabi5-2突变体2 d发芽率显著高于‘日本晴’,二者4 d的萌发势也是osabi5-2突变体略高。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsABI5突变体,对研究水稻OsABI5调控种子萌发的分子机制具有重要意义。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsWOX9C基因突变体

WUSCHEL-Related HOMEOBOX(WOX)基因家族是植物所特有的一类转录因子基因家族,该家族成员在植物发育的不同过程中发挥了重要的调节功能。相比于双子叶模式植物拟南芥,对于单子叶模式植物水稻中WOX基因家族成员功能的了解还很不充分。水稻DWT1/OsWOX9隶属于WOX基因家族的中间支,该基因在水稻主穗和分蘖穗的协同生长中起到了重要的调节作用。OsWOX9B和OsWOX9C是水稻中与DWT1/OsWOX9最为同源的基因,并具有相似的表达模式,但是否具有相似的生物学功能尚不清除。为了研究水稻WOX基因家族成员OsWOX9C的功能,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑体系,设计了水稻WOX家族基因OsWOX9C(LOC_Os05g48990)的敲除靶点,构建了OsWOX9C基因的敲除载体。通过对OsWOX9C基因序列分析,将合成的靶点序列插入p BIN-sg R-Cas9-Os载体中,构建p BIN-sg R-Cas9-Os-Target载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻品种9522。从5株T0代转基因苗中鉴定出1株OsWOX9C突变的杂合突变体,并通过对自交分离群体的测序分析,筛选出OsWOX9C的四种突变类型。这四种突变体的突变位点均在外显子第146位碱基处,包括插入碱基A或T的两种纯合突变类型,以及插入A/T或C/T的两种双等位突变类型。通过蛋白序列分析,发现这四种突变株系均导致移码而使氨基酸提前终止致使基因突变。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了水稻OsWOX9C基因的敲除突变体,为进一步研究OsWOX9C基因的功能提供了重要的遗传材料。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻过氧化氢酶基因OsCAT

过氧化氢酶(catalase,CAT)作为重要的抗氧化酶,可催化细胞内过氧化氢的分解,为了研究水稻过氧化氢酶基因OsCAT2的功能,首先根据在线软件http://crispr.mit.edu/搜寻向导sg RNA序列,选择OsCAT2基因第三外显子上的"GTGGAGAACCGAACAATAACTGG"作为目标靶序列,然后构建了OsCAT2的CRISPR/Cas9载体BGK03-OsCAT2,将目的载体转化水稻粳稻9522后共获得了7个独立的转基因株系,其中包括在PAM附近发生编辑的独立转基因株系2个,编辑方式主要表现为缺失和错配。与野生型相比,转基因植株较矮、分蘖数增加、叶片呈明显的病叶状、成熟时期育性明显降低,这为深入研究水稻OsCAT2基因的作用机制提供了帮助。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻温敏不育基因TMS5

Thermo-sensitive genic male-sterile (TGMS) gene tms5 is most widely used in the two-line hybrid breeding system in China. To develop novel rice thermo-sensitive male sterile lines, we knocked out the TMS5 genes of six elite japonica and four indica rice varieties by using CRISPR/Cas9 gene editing technology. By analyzing the critical sterility-inducing temperature (CIST) of the newly TGMS lines, it was found that the CIST of japonica TGMS lines ZG75S, CYGS, YG0618S, ZG07S, T0361S, and 7679S were between 28°C and 32°C, the CIST of indica TGMS lines 2537S, 6150S and 6379S were between 24°C and 28°C, and the CIST of indica TGMS line 1109S was lower than 23.5°C. These results indicated that the CIST of tms5 mutant from different genetic background materials was different. The TGMS lines with lower CIST could be obtained by knocking out the TMS5 from different genetic background materials. A hybrid rice combination 1109S/8048 had high quality and high yield. The yield of 1109S/8048 was 13.1% higher than that of Fengliangyou 4. The creation of the TGMS 1109S and the high-yield cross combination 1109S/8048 provides a new way for high-yield breeding.     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsSLR1敲除突变体

GA是种子萌发的促进因子,能解除种子休眠和刺激萌发,GA的信号通路可以通过对DELLA蛋白的去抑制作用来完成的。通过对不同物种的DELLA蛋白功能的研究,发现不同物种的DELLA蛋白的功能具有高度保守性,本实验主要研究水稻中的DELLA蛋白SLR1,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsSLR1基因敲除突变株。首先,通过对OsSLR1的结构和功能域进行分析比对,最终选择3个靶点;然后,利用重组法构建CRISPR/Cas9敲除载体;最后,通过农杆菌介导法,将敲除载体转染成熟的日本晴水稻愈伤,待培育出幼苗,通过PCR和Western Blot进行鉴定。最终筛选得到1株Os SLR1敲除突变株系slr1-1,通过观察突变体萌发表型,发现slr1-1突变体第2天发芽率显著高于日本晴,而且slr1-1突变体的生长速度显著快于日本晴。通过不同浓度PAC对slr1-1突变体萌发表型的影响,发现水稻的DELLA蛋白SLR1敲出的突变体种子萌发不受PAC抑制,表明OsSLR1是通过调控GA信号途径影响水稻种子的萌发,详细的调控机制和互作蛋白等还有待深入的研究。通过对SLR1调控GA信号通路控制水...     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻osarf8-1杂合突变体

为了研究生长素是如何参与调控植物的生长发育过程,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,设计水稻生长素响应因子OsARF8的两个靶点,对水稻中的该基因进行敲除。构建基因编辑载体pBIN-sg R-Cas-Os,通过农杆菌介导转化水稻品种‘9522’。我们从潮霉素抗性筛选出的28株转基因植株中鉴定得到针对OsARF8的一种杂合突变类型,共计6棵在外显子第174号碱基处缺失一个C碱基的杂合突变类型osarf8-1,该处碱基突变所对应的是第7个氨基酸的变化,导致亮氨酸(Leu)变成色氨酸(Trp),自此处开始随后的氨基酸序列发生移码突变,并且提前终止于第123个氨基酸,正好位于Os ARF蛋白的DBD功能域的最始端(DBD为120~222个氨基酸),说明DBD功能域在该突变体中完全不能表达,ARF8蛋白的功能将受到极大的影响。本研究成功利用CRISPR-Cas9基因编辑技术精确地敲除了水稻OsARF8基因,为CRISPR技术在水稻中的应用提供了一个可供参考的范例,同时也为进一步研究OsARF8基因功能提供了重要的参考依据。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对CSSL37的YSA基因进行定点编辑

水稻是中国乃至世界重要的粮食作物之一,作物染色体片段置换系群体是作物新资源的挖掘、数量遗传研究和杂种优势利用研究的理想工具和材料。CRISPR-Cas9技术是近年发展起来的一种快速基因编辑技术,通过该技术已对多种植物的基因组进行了编辑。YSA的突变体ysa,由于在编码区5个碱基的缺失导致白化的性状,ysa在3叶期以前发育出白化叶,之后叶片逐渐变绿,到6叶期完全恢复成正常绿色。本研究利用CRISPR-Cas9技术,构建同时含有2个sg RNA载体,以CSSL37株系为材料,通过对YSA基因进行定向编辑和修饰。结果表明,获得CSSL37株系的转基因苗20株,有18个株系在目标区域内序列均发生变化,其中有2个株系在T0代已经纯合,出现目标性状的表型。该研究为进一步利用基因编辑体系和创制优异的水稻新材料提供了帮助。     

水稻旱育秧培育技术

2011～2012年福建省大田县广平镇万亩双季稻高产创建示范片被农业部列为粮油高产创建项目之一。在项目实施过程中该县农业局与广平镇协调配合,在示范区元沙村建立了百亩农业“五新”技术核心示范片,大力推广“六统一、一精确”综合技术。“六统一”是统一购置良种,统一制定关键技术,统一浸种育秧、培育壮秧,统一机耕、机插,统一综合防控病虫,统一投保（水稻保险）;一精确是结合测土配方,精确定量施肥。“六统一、一精确”综合技术的核心是培育水稻旱育秧,现将其要点介绍如下：     

粳糯水稻新品种宜糯931

粳糯水稻新品种宜糯931宜糯931是四川省宜宾市农科所杂交选育的粳型中熟糯稻新品种,1997年通过了四川省农作物品种审定委员会的审定。1995－1996年在宜宾市示范140万hm²,产量5089.5－7800.0kg/hm²,比对照增产……     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得AtLCR67基因敲除突变体

拟南芥AtLCR67基因属于低分子量富含半胱氨酸(low-molecular-weight cysteine-rich,LCR)基因家族。在正常生长条件下,该基因在发育的种子中特异表达。为了研究该基因在发育或代谢过程中的可能作用,在没有合适T-DNA插入突变缺乏的情况下,我们利用CRISPR-Cas9定向敲除技术来创制该基因沉默的拟南芥突变体材料。通过构建AtLCR67基因的CRISPR-Cas9敲除质粒,借助农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥Col-0,最终获得12株T0代转基因植株。对T0转基因植株的AtLCR67基因进行测序分析发现,在设计的靶位点处存在短片段缺失12个碱基和增加一个T碱基两种突变类型,进一步做RT-PCR检测分析发现突变体中AtLCR67基因完全不表达,说明成功获得拟南芥lcr67突变体。突变体材料的获得为进一步研究AtLCR67基因在发育或代谢方面的的功能奠定了良好基础。     

利用基因沉默技术创造抗稻瘟病水稻资源

水稻稻瘟病是最具毁灭性的病害之一,严重地影响水稻的高产和稳产。在病原菌侵染水稻时,附着胞的形成对稻瘟病菌的致病性起着关键作用。研究证实一种P型ATP酶（ P-ATPase）参与了附着胞的形成。在病原菌与寄主的互作过程中,寄主的一些小分子物质可以进入病原菌中,达到抗病原菌侵染的目的。以稻瘟菌致病关键的P-AT-Pase基因MgAPT2第一外显子上特异性好的232 bp的区域作为干扰片段,正反向插入干扰载体中,通过农杆菌介导,转化到感稻瘟病水稻品种日本晴中,通过苗期稻瘟病接种鉴定和MgAPT2基因的表达检测,结果表明：转基因植株稻瘟病抗性得到增强且稻瘟病菌MgAPT2基因的表达量下降,为水稻抗稻瘟病种质资源的创新提供了新思路。     

水稻粘性和糯性的遗传及其应用

在水稻育种实践中,通过粘稻与糯稻杂交,已育成不少品种(系)。近年来,粘糯混合杂交稻也选育成功。本所用台雄2号(粳糯)与TR28(籼粘)杂交,育成籼糯品系台八-5,较好地综合了双亲的耐寒、抗病、青秆黄熟等优点。台八—5是优良恢复系,用它与泸南早1号A、珍汕97A、军协A等不育系配置的粘