文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

植物WRKY转录因子研究进展

转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的调控作用。典型的转录因子含有DNA结合域,转录调控域,寡聚化位点和核定位信号,转录因子通过这些结构域与相应的顺式元件相互作用调控基因的表达。WRKY转录因子是植物中特有的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的一种转录调控因子,它能够与(T)(T)TGAC(C/T)序列（W-box）发生特异性结合,从而调节启动子中含W-box元件的调节基因和/或功能基因的表达,参与植物的各种生理生化反应。文章主要论述近年来植物WRKY转录因子的相关研究进展。     

猪STAB2基因启动子的克隆及转录活性分析

旨在克隆和分析猪STAB2基因启动子及其转录活性。利用基因克隆、双荧光素酶报告基因系统以及生物信息学分析等方法,克隆得到了STAB2基因转录起始位点上游1 997 bp的候选启动子序列并对其序列特征进行了分析,同时,构建了不同长度的5'端缺失的重组载体并利用双荧光素酶报告基因系统分析了其荧光素酶活性,进而确定了STAB2基因的核心启动子区域及关键调控区域,并对关键调控区域内的转录因子及其结合位点进行了分析。结果表明:STAB2基因的候选启动子区域内包含4个核心启动子和1个Cp G岛;-309--39 bp为STAB2基因的关键调控区域,-1 045--309 bp可能存在一个正向调控元件,而-1 506--1 045 bp可能存在一个负向调控元件; STAB2基因的关键调控区域内包含72个转录因子结合位点,部分转录因子在这一区域具有多个结合位点,如Arnt∶∶Ahr、ZNF354C、Klf4和KLF5,并且,转录因子结合位点之间也存在重合区。为进一步研究猪STAB2基因的表达调控机制以及其在调控猪抗病和肌肉品质中的功能提供了理论依据。     

甘蓝型油菜A7-FT启动子的功能分析

为了利用PCR技术得到甘蓝型油菜A7-FT基因启动子序列,根据甘蓝型油菜全基因组序列,利用启动子在线预测软件预测其功能与结构,根据其预测的顺式元件的分布,从5′端开始缺失的方式获得5个不同片段长度的启动子序列。构建含不同片段长度启动子的GUS基因表达载体,利用农杆菌介导拟南芥,得到T_2幼苗,经过GUS染色与脱色,探讨A7-FT基因启动子的功能,为研究甘蓝型油菜开花调控机制提供理论基础。通过PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因DNA中获得A7-FT基因启动子序列。利用PLACE和PlantCARE在线工具对该段序列进行预测,发现A7-FT基因启动子除了存在启动子核心元件CAATbox和TATAbox,还有光应答元件、激素应答元件、胚乳表达应答元件、抗逆性应答元件、生理控制相关的顺式作用元件。基于预测的顺式作用元件的分布情况,设计特异性引物,克隆不同片段长度启动子,与pCAMBIA1303载体构建5′端缺失载体,分别命名为M1、M2、M3、M4、M5。通过农杆菌介导拟南芥,GUS染色与脱色结果显示,在-1 549～-238可能存在一些负调控元件的结合位点,而-238～+1区域是该启动子的核心区段。     

猪EIF2S3基因启动子的克隆、活性及转录调控元件分析

旨在初步分析猪EIF2S3基因的启动子活性以及转录调控元件。利用生物信息学分析、PCR扩增、基因克隆、细胞转染、双荧光素酶活性分析等方法,获得了EIF2S3基因启动子区域的序列特征,构建了不同片段长度的EIF2S3基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体并分析了其荧光素酶活性,进而确定了EIF2S3基因的核心启动子区域以及关键的调控区域,最后还预测了关键调控区域的转录因子及其结合位点。结果表明,EIF2S3基因候选启动子区包含3个核心启动子以及2个Cp G岛;-706～+200 bp为EIF2S3基因的核心启动子区域,-706～-253 bp为EIF2S3基因启动子的关键调控区域,且发挥正向调节作用,而-1 563～-706 bp不存在任何对EIF2S3基因启动子活性有影响的调控元件; EIF2S3基因启动子的关键调控区域包含440个转录因子结合位点,且多个转录因子在此区域均有多个结合位点,如SP1、KLF4、Myo D1、Myo G、NFKB1。为进一步研究猪EIF2S3基因的表达机制奠定了基础。     

蓝莓VcMYB启动子克隆及其功能初步分析

为探究VcMYB启动子在转录过程中如何发挥调控作用,利用FPNI-PCR法从蓝莓中克隆到调控原花青素合成相关的转录因子VcMYB的768 bp启动子序列。用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析了该启动子,结果表明其序列中存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,还包含一系列的响应元件,如光响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等。为进一步分析该启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体VcMYBpro::GUS,并用农杆菌转化拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果表明该VcMYB启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥中表达,并且经脱落酸(ABA)、4℃低温、LED光照和持续光照处理后,转基因拟南芥中GUS的表达活性增强,推测该基因受ABA、低温和光的调控。     

牛筋草EPSPS基因启动子对草甘膦的响应

杂草对草甘膦抗药性机理及抗草甘膦转基因作物研究主要围绕草甘膦靶标酶EPSPS展开,EPSPS基因表达量增加是杂草抵抗草甘膦胁迫的主要分子机制之一,但EPSPS基因表达调控机理及其对草甘膦的响应却鲜有研究。本研究根据Gen Bank中牛筋草EPSPS基因启动子序列设计引物,从牛筋草基因组DNA中扩增EPSPS基因启动子序列及其5'端缺失序列;将各启动子片段构建到含绿色荧光蛋白基因GFP的p35S-GFP载体上,在农杆菌的介导下,利用洋葱表皮细胞瞬时转染体系分析EPSPS基因启动子活性及对草甘膦的响应,结果表明,各启动子片段均能启动下游基因的表达,具有较强的启动子活性,可作为较好的实验材料用于抗草甘膦转基因作物的研究。此外,EPSPS基因启动子能够响应草甘膦信号,调节下游GFP基因的表达,响应元件可能存在于3'端的345 bp内。研究结果有助于进一步丰实杂草对草甘膦抗药性机理及抗草甘膦转基因作物研究的理论基础。     

油棕脂肪酸脱饱和酶基因ω3启动子区的克隆及其表达组织特异性分析

本研究是以油棕叶片基因组DNA为模板,通过数据库预测的油棕脱饱和酶基因ω3的启动子序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增及TA克隆的方法得到了长度为1 144 bp油棕脱饱和酶基因ω3启动子序列。通过Plant CARE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子不仅含有转录必备的CAAT-box和TATA box,还有大量相关的光反应元件和激素响应元件。通过构建含gus的植物表达载体,农杆菌介导转化转基因拟南芥,对转基因拟南芥进行活性表达分析。结果表明:克隆获得的启动子序列和下游gus基因已经稳定的整合到获得的转基因拟南芥基因组当中;同时,gus基因在拟南芥不同组织中体现出明显的组织特异性,其中,茎干处表达量最高,在叶片的叶脉处表达次之。说明ω3启动子具有活性,可以启动目的基因的转录,本研究为进一步研究启动子的功能及基因表达调控奠定了基础。     

银杏FLS基因启动子克隆及序列分析

黄酮醇合成酶基因（FLS）是黄酮类化合物合成通路中的重要基因,直接决定着银杏黄酮类化合物的积累量。为了探索FLS基因在转录水平上的表达调控机制,本文在克隆银杏FLS基因启动子序列的基础上,利用生物信息学方法,分析了该基因的启动子结构。结果表明,FLS基因启动子中包含了3个MYB转录因子结合位点和9个光信号应答位点,为确立银杏FLS基因与CHI基因间的共调控关系及揭示FLS基因应答光信号的转录调控机制提供了分子基础。     

玫瑰RdGASA4-like基因启动子的分离及其在甘蓝中的瞬时表达分析

在前期的研究中,一个玫瑰RdGASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长利用同源克隆结合RACE的方法首次得到克隆。为深入了解该基因在赤霉素调控植物发育过程中的作用,通过TAIL-PCR的方法首次克隆该基因起始密码子ATG上游685bp的5’-UTR和部分启动子序列,在启动子序列分析的基础上,构建其与GUS基因融合表达载体,命名为pBI-GP685。通过农杆菌介导的方法对甘蓝外植体子叶-子叶柄进行启动子瞬时表达研究,结果表明分离得到的启动子具有启动报告基因GUS表达的活性。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。     

水稻肽链释放因子OseRF1-3基因克隆、表达及启动子分析

为了揭示水稻中肽链释放因子eRF1在蛋白质生物合成中的作用,对水稻eRF1基因的全长cDNA和启动子进行了克隆与表达模式分析。通过RT-PCR技术克隆获得1个水稻eRF1基因,命名为OseRF1-3,序列分析表明,该基因CDS序列全长1 308 bp,编码436个氨基酸,包含N、M、C共3个保守结构域。qRT-PCR结果表明,OseRF1-3是组成型表达,在水稻穗中表达最高。以水稻叶片基因组DNA为模板,通过PCR技术克隆了该基因起始密码子上游2 120 bp启动子序列,构建该基因启动子融合GUS植物表达载体,并通过农杆菌介导法导入水稻愈伤组织。GUS组织化学染色分析表明,OseRF1-3基因启动子驱动GUS基因在水稻各组织部位都表达即组成型表达,在根中表达较弱,在水稻花、硬壳中检测到GUS基因较强表达。GUS检测OseRF1-3基因启动子驱动GUS表达的结果与qRT-PCR得出的结果相一致。因此,该研究将为进一步探索OseRF1-3基因的功能奠定理论基础。     

梭梭HaNAC2基因克隆、表达分析及亚细胞定位

本研究从梭梭中克隆得到1个NAC转录因子,命名为HaNAC2。同源性比对分析结果显示该基因含有典型的NAC蛋白结构域。系统发育分析结果推测该蛋白属于NAC家族第Ⅰ组的SENU5亚家族,组织特异性分析结果表明该基因在梭梭同化枝中表达量最高,荧光定量PCR结果显示该基因的表达量随干旱胁迫时间的增加而升高,推测其表达受干旱胁迫诱导。本研究克隆了该基因的启动子并进行分析,结果发现HaNAC2基因的启动子含有启动子固有元件,如TATA-box,CAAT-box等,还含有一些调控元件如MYB结合位点、组织特异性表达响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列。通过PEG介导的原生质体转化法进行亚细胞定位分析,结果显示该蛋白定位于细胞核。本研究初步探索了HaNAC2基因的表达及定位,为进一步研究该基因在梭梭抗旱中的功能打下基础。     

陆地棉开花相关基因GhFLP1的克隆与功能验证

为了明确陆地棉开花促进因子基因的作用,以中棉所36叶片基因组DNA和cDNA为材料克隆得到了开花相关基因Gh FLP1,分析了其特征及功能。该基因全长为537 bp,包含339 bp开放阅读框,编码112个氨基酸。预测分子量约为12.176 kDa,理论等电点为9.13。组织特异性表达分析表明,该基因在花蕾中优势表达,且在早熟品种(中棉所36、中棉所74)中表达量高于中熟品种(中棉所60、鲁棉研28)。启动子序列分析和外源激素处理实验表明该基因受水杨酸和赤霉素调控。农杆菌介导转化拟南芥发现,该基因能促使拟南芥莲座叶减少,开花期提前。荧光定量结果表明,在转基因拟南芥中,内源开花相关基因AtFT、AtLFY、AtAP1和AtSOC1表达量不同程度上调,AtFUL表达量基本不变,AtFLC表达量下调。研究结果显示该基因可能参与陆地棉开花时间的调控,为创制转基因早熟棉花新材料打下基础。     

苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)启动子区

通过研究苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)的启动子来探索MdGA3ox1的转录调控机制。采用染色体步移法结合锚定PCR法扩增了MdGA3ox1的上游序列,用PLANT CARE启动子分析软件分析此启动子序列,并把其构建到载体上,转化入根癌农杆菌中初步验证了其功能。获得一个754 bp的DNA序列,分析此序列发现有CAATbox、TATAbox、赤霉素、光、乙烯、脱落酸等顺式反应元件。把此序列构建到pCAMBIA 1381载体上,并把此质粒命名为p1381-GA3ox1p。把p1381-GA3ox1p转化入农杆菌EHA105中,利用GUS染色液染色,农杆菌呈蓝色。获得了MdGA3ox1的上游序列,此序列上含有与GA调节相关的顺式反应元件,并且初步证明此序列具有启动子活性。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素-C基因启动子区的克隆与序列分析

摘要：根据GenBank上已发表的猪甘露聚糖结合凝集素C基因启动子区序列,设计一对特异性引物,通过RT-PCR法成功的从长白猪肝脏中克隆到MBL-C基因启动子区序列。扩增序列全长2030bp,与已发表的该序列相比具有3个SNPs位点,即-1636位点为T,-1614位点为A,-251位点为C,在-251位点与高水平表达的pMBL-C启动子区位点不同,从A突变为C。本研究为下一步分析pMBL-C的启动子区多态性奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnLPAT4启动子的克隆及表达分析

植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid acyltansferase,LPAT)是在植物不同组织中调控溶血磷脂酸生成各种磷脂酸的代谢流的关键酶。本研究采用同源克隆的方法,从甘蓝型油菜湘油15中克隆BnLPAT4基因翻译起始位点上游的调控序列,长度为1 326 bp。Plantcare在线分析表明:该序列含有CAAT-box和TATA-box等核心启动子原件,同时还有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件等。将该启动子与GUS基因融合,构建pBnLPAT4:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导法获得拟南芥T3代转基因株系。GUS组织化学染色显示,幼苗期的转基因拟南芥在叶和根部均具有GUS活性,成熟期在莲座叶、花瓣、花萼、花托及果荚中表达,而花药及种子中未检测到GUS活性。     

猪CRYBB2基因启动子的克隆、活性及转录调控元件分析

旨在初步分析猪CRYBB2的启动子活性以及转录调控元件。利用生物信息学分析、PCR扩增、基因克隆、细胞转染、双荧光素酶活性分析等方法,获得了CRYBB2启动子区域的序列特征,构建了不同片段长度的CRYBB2启动子区的双荧光素酶报告基因载体并分析了其荧光素酶活性,进而确定了CRYBB2的核心启动子区域以及关键的调控区域,最后还预测了关键调控区域的转录因子及其结合位点。结果表明,CRYBB2候选启动子区可能包含4个核心启动子以及1个CpG岛,-52～-3 bp可能为CRYBB2基因的核心启动子区域,-505～-19 bp为CRYBB2基因启动子的关键调控区域,且发挥正向调节作用,而-2 060～-505 bp不存在任何对CRYBB2基因启动子活性有影响的调控元件;CRYBB2启动子的关键调控区域包含多个潜在的转录因子结合位点,如TBP、NFIA、FOXP1、NKX2-8、KLF4、Tcf3、Crx、SNAI3、Rfx1和CREB1等。为进一步研究猪CRYBB2的表达机制奠定了基础。     

中国红豆杉中WRKY转录因子基因克隆及其对紫杉烷合成的调控

WRKY是一类专一结合W-box序列的转录因子,它对植物抗病、损伤、衰老等生物学过程起到调控作用,尤其是在植物次级代谢物质合成中起到了重要调控作用。本研究采用中国红豆杉细胞转录组数据库序列设计引物,从中国红豆杉基因组中克隆转录因子基因TcWRKY26,该基因大小为2 202 bp;构建pBI121超表达载体,转化农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导转化红豆杉细胞,继而基于RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,发现转录因子基因明显超表达,相对表达量提高了2.92～3.49倍,紫杉烷合成相关酶dbat基因也有明显的超表达,相对表达量提高了1.78～2.03倍,说明TcWRKY26基因对dbat基因有明显的上调作用,继而为构建高产、稳定的红豆杉基因改良细胞株提供参考依据。