冬瓜SSR-PCR体系优化及引物筛选

本研究利用L16(54)正交试验设计研究了影响冬瓜SSR-PCR的五个因子(10×Buffer(含Mg2+),d NTP,DNA,引物,r Taq),研究结果表明Buffer(含Mg2+)和r Taq对PCR影响最明显,最终筛选出最佳反应体系:10×Buffer 2.0μL(1×Buffer),d NTP 2.0μL(200μmol/μL),DNA 0.6μL(6 ng/μL),引物0.4μL(0.2μmol/L)。体系体积为20μL,循环数为35。引物筛选程序为:94℃预变性3 min,94℃变性45 s,58℃~68℃复性30 s,5个循环,每个循环退火温度降2℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃~58℃复性1 min,8个循环,每个循环退火温度降低1℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃复性30 s,72℃延伸1 min,共30个循环,72℃延伸7 min。本研究建立了适合冬瓜的SSR反应体系和引物多态性筛选程序。     

红芪ISSR-PCR体系的建立及优化

通过单因素与中心复合设计相结合的方法建立优化红芪ISSR-PCR反应体系,并筛选引物,优化电泳时间及扩增循环数。建立的红芪ISSR-PCR反应体系为:25μL反应体系中10×PCR Buffer(Mg~(2+))3.5μL、模板DNA(30 ng/μL)2μL、PCR扩增引物2μL、Taq DNA聚合酶为1.25 U、d NTPs为2μL,dd H_2O 14.5μL,建立的扩增程序:94℃预变性5 min,开始34个循环;94℃变性30 s,后据不同退火温度的引物复性45 s,72℃延伸2 min,循环结束后72℃延伸7 min。本研究筛选出红芪扩增的引物17条;PCR反应产物电泳时间为120 min,最佳循环数为34,建立了稳定的体系,为进一步研究红芪的遗传多样性及遗传结构提供了帮助。     

黄枝油杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

先运用正交设计进行初步筛选,再用单因素设计逐一优化对ISSR-PCR扩增效果有影响的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、模板DNA、循环次数及退火温度.建立了黄枝油杉的最佳反应体系和程序,即25μL体系中含2.0mmol/L的Mg2+、1.5U Taq DNA聚合酶、0.10mmol/L的dNTP、1.0μmol/L的引物、30ng的模板DNA以及2.5μL10×PCR buffer,其余的用灭菌的ddH2O补够25μL.扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～56℃(不同的引物,其退火温度不同,根据具体引物而定)退火45s,72℃延伸90s,以上3个步骤循环50次;最后72℃延伸7min;扩增产物放在4℃冰箱中保存.该体系和程序稳定性良好,结果可靠,可用于黄枝油杉遗传多样性分析.     

缘毛雀麦ISSR—PCR反应体系的建立和优化

以缘毛雀麦基因组DNA为模板,对ISSR反应体系中的一些重要参数进行探索和优化试验,初步建立了一套雀麦属牧草ISSR分析的优化反应体系及反应程序.在20μl反应体系中,含有2.0 mmol/L Mg2+、2.0 U Taq酶、O.3 mmol/L dNTP、0.5/μmol/L引物和30 ng模板DNA.反应程序:第1个循环,基因组DNA经94℃预变性5 min;45个循环为94℃变性45 S,54℃退火60 s,72℃延伸90 s;最后1个循环完成后,在72℃下延伸7 min.     

鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16(44)正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序.在15μL体系中各反应的最适合含量为:50ng模板DNA,240μmol/L dNTP,0.4μmol/L SSR引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,1.5μL 10×PCR Buffer,2.5mmol/L MgC12.PCR适宜扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性30 s,52℃复性30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃.同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对.用于鸭茅SSR标记的进一步研究.     

花吊丝竹ISSR-PCR反应体系的正交优化

本研究利用L16(45)正交试验设计,对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,Taq DNA聚合酶浓度,引物浓度及模板DNA含量)进行优化。并在50~60℃范围内摸索引物UBC845的最适退火温度,并建立了花吊丝竹的最佳ISSR-PCR反应体系:2.5 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,80 ng模板DNA,2μL 10x Buffer,9.5μL dd H2O,ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。利用优化的反应体系从100条引物中筛选出16条多态性较好的引物,该体系的建立有助于花吊丝竹种质资源遗传多样性分析和指纹图谱的构建。     

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。     

胡椒SRAP反应体系的建立和优化

建立并优化胡椒SRAP分子标记体系,为海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析、物种和品种鉴定等打下技术基础。利用单因素随机试验对胡椒SRAP-PCR反应体系中各组分（Taq DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、引物和Mg2+）的浓度进行优化,同时筛选SRAP-PCR反应的循环数和最适退火温度。通过实验确定了SRAP-PCR反应体系为：反应总体系为20 μL,其中引物0.35 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTP 0.6 mmol/L,Mg2 + 1.5 mmol/L,模板DNA 25~200 ng,同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度;最佳SRAP-PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,35℃退火30 s,72℃延伸45 s,5个循环;然后94℃变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸45 s,40个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存。SRAP-PCR体系适为胡椒属植物遗传多样性分析奠定了基础,并成功地应用于海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析。     

刺梨ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以刺梨为试材,对影响ISSR-PCR扩增结果的主要影响因素包括Mg2+,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模版DNA的浓度及引物退火温度进行了优化筛选.确立了适合刺梨ISSR-PCR分析的最佳反应体系,即20 μL反应体系中各组分浓度分别为:10×buffer2.0 μL,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,dNZPs0.1 mmol/L,引物2.μ mol/L,模板DNA20ng.PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性1 min,48℃退火温度45 s,72℃延伸1 min,34个循环,72℃后延伸6min.利用优化体系对3个刺梨品种进行体系稳定性检测,结果表明该优化体系的重复性和稳定性良好.     

块根紫金牛ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立块根紫金牛ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即25 ul的体系中含Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP0.15 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,模板DNA50ng,10×Buffer 2.5μl.适宜的扩增程序是94℃预变性5 min,94℃变性30s,56.6℃退火45s,70℃延伸2.0 min;45个循环;72℃延伸7min,4℃保存.采用正交和单因素试验可快速建立ISSR-PCR反应体系.该体系稳定、可靠,可用于块根紫金牛遗传多样性分析.     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR－PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系：PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min     

巴戟天ISSR体系的建立与优化

以巴戟天叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于巴戟天的ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件,即20μl PCR反应体积中含0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,50 ng模板DNA.PCR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,53.4℃退火45 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.应用该ISSR体系对6份巴戟天种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

广东紫珠ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选

为建立稳定性、重复性好的广东紫珠ISSR-PCR反应体系,以广东紫珠总DNA为试验材料,通过单因子结合正交试验对模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、引物浓度和Taq酶用量进行优化,确立了适用于广东紫珠的最佳ISSR-PCR反应体系：0.25 mmol/LdNTPs、1.00 U Taq DNA聚合酶、0.75μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg²⁺、100 ng模板DNA,总反应体积为25μL。同时建立重复性和稳定性均较好的ISSR-PCR扩增程序：预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火温度与每个引物相对应,退火45 s;72℃延伸90 s;34个循环;后72℃延伸10 min;4℃保存,扩增结束。用来自不同居群4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的20个引物。     

大白菜SSR检测体系的优化

以不同地区栽培的5份大白菜品种为试材,从PCR反应组成、扩增程序、电泳检测等环节对SSR技术进行了优化,建立了一套适用于大白菜品种鉴定的SSR-PCR体系.即10 μL反应组成为:1×buffer;2.50 mmol/L MgCl2;0.10 mmol/L dNTPs;0.35 μmol/L SSR引物;1.00 ng/μL模板DNA和0.40 U Taq酶.适宜的扩增程序为72℃热启动3 min,94℃预变性2 min后进行20个迫降循环:94℃变性60 s,68℃退火60 s,72℃延伸45 s(-1℃ /2 cycles);再进行20个循环:94℃变性60 s,58℃退火60 s,72℃延伸45 s,72℃延伸10 min.应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(银染)电泳检测并取得很好的效果.选用108对芸薹属SSR引物,对这5份品种的基因组进行扩增,筛选出具有2条以上特异扩增条带的SSR引物22对.用这些引物对5份品种进行扩增,初步分析了SSR标记的多态性及用于大白菜指纹分析的潜力.     

毛竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg²⁺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA浓度及退火温度对毛竹ISSR-PCR扩增效果的影响。毛竹ISSR-PCR反应体系为:25μL的体系中含Mg²⁺1.5 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0 U,模板DNA 30 ng,10×Buffer2.5μL。扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,54℃退火60 s,72℃延伸1.5 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该体系稳定、可靠,可用于毛竹遗传多样性分析。     

草莓SRAP反应体系优化及引物筛选

为建立草莓SRAP-PCR适宜的反应体系,以草莓品种‘丰香’为实验材料,采用单因素实验设计,对Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物浓度4个因素4水平进行优化,并在此基础上对模板DNA的浓度和退火温度进行优化。结果表明,草莓SRAP-PCR最佳反应体系为：20μL的反应体系中含10×PCR buffer 2μL,Mg²⁺ 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,正反向引物各为0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为100 ng。扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。利用该优化体系筛选引物,从110对SRAP引物组合中筛选出29对条带清晰丰富、多态性好的引物,证明了此优化体系稳定可靠,能够用于草莓种质资源的鉴定、分子标记辅助育种等研究。     

正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系

以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。     

狭叶坡垒RAPD-PCR反应体系优化

以濒危物种狭叶坡垒硅胶干燥的叶片为材料,研究其RAPD-PCR体系优化条件.结果表明,优化的狭叶坡垒RAPD-PCR反应体系为:25μL体系中1×PCR buffer,3 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,0.5 U/25μL Taq聚合酶,0.4μmol/L引物,5 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,35℃退火1 min,72℃延伸1.5min,35个循环;72℃最后延伸7 min.     

花生基因组SRAP-PCR体系的优化

【研究目的】研究花生基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系;【方法】对模板DNA、引物、dNTP mixture、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度设置不同梯度,研究各因素对PCR结果的影响;【结果】扩增程序为:94℃变性2min,1Cycle;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,40Cycles;72℃延伸7min。反应体系成份为:DNA模板80ng,左右引物各200ng,dNTP mixture2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶3U,10×Buffer8μl,总体积60μl。【结论】建立了满足花生基因组SRAP-PCR的优化扩增体系。     

香蕉RAPD反应体系的建立

利用改良的CTAB方法从香蕉叶片中提取高质量的DNA。在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,经过反复试验,确定适合香蕉PCR扩增程序为：94℃预变性 5min;94℃变性 1min;38℃退火 1min;72℃延伸 2min;变性ó延伸,循环45次;最后72℃延伸 2min。PCR扩增的体系（总体积25μL）为：模板DNA 20ng,dNTP 200μmol/L,10×PCR Buffer2.5μL,引物0.20μmol/L,Taq酶0.75U,ddH2O17.85μL。