薰衣草ISSR-PCR反应体系的正交优化

本研究以19份薰衣草品种为材料,采用正交设计对ISSR-PCR反应中的5个影响因素:DNA浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度、引物浓度、d NTP浓度,进行5个水平的优化试验,并在48℃~59℃范围内摸索退火温度。研究结果建立了稳定的、可重复的薰衣草ISSR最佳反应体系和PCR扩增参数。在20μL的反应体系中,DNA模板浓度为2.50 ng/μL,Mg2+浓度为2.00 mmol/L,d NTP浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.40μmol/L,Taq DNA聚合酶为0.75 U,退火温度为52℃。该体系可为开展薰衣草种质资源的遗传多样性分析评价奠定基础。     

丝瓜SRAP反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对SRAP反应中主要五个影响因素d NTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、DNA模板浓度、Mg~(2+)浓度进行优化,建立丝瓜SRAP-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为25μL SRAP体系。25μL SRAP体系为:75 ng DNA,0.2 mmol/L d NTP,1.25 U Taq酶,0.16μmol/L的单条引物,2.0 mmol/L Mg~(2+),2.5μL 10×Buffer。选用33个丝瓜品种对所确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的SRAP分子标记。     

郁金香ISSR-PCR体系建立与优化

本研究以22个郁金香品种为材料,采用正交设计试验和单因素试验对ISSR-PCR反应中的5个影响因素:Mg~(2+)、d NTPs、Taq酶、引物、模板DNA进行4个水平的优化试验。结果表明最佳反应体系为:25μL体系中Mg~(2+)1.0 mmol/L、d NTPs 0.15 mmol/L、Taq酶0.25U、引物0.2μmol/L、模板DNA 100 ng。退火温度为58℃。该体系的建立有利于ISSR分子标记技术研究郁金香种质资源遗传多样性。     

丝瓜ISSR反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对ISSR反应中主要5个影响因素Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度,建立丝瓜ISSR-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为:25μL ISSR体系:50 ng DNA,0.2 mmol/L dNTP,1 U Taq酶,0.4μmol/L的单条引物,2.5μL 10×Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+)。在此基础上,对12个引物的退火温度进行优化。最终选用60份丝瓜品种对所确定的扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高和重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的ISSR分子标记为丝瓜种质资源的鉴定、分类和丝瓜的杂交育种提供参考依据。     

花椰菜EST-SSR反应体系的优化

为获得花椰菜EST-SSR优化扩增体系,本研究以‘喜美’花椰菜为材料,采用单因素试验对EST-SSR反应体系的Mg2+、d NTP、Taq酶、引物和DNA浓度分别进行优化。研究结果表明,花椰菜EST-SSR25μL优化反应体系为:2.5μL 10×Buffer,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L d NTP,1 U Taq酶,0.56 mmol/L引物,100 ng DNA。利用该反应体系,选用引物EST529-1在10个花椰菜品种中进行优化反应体系的验证。结果显示扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富且特异性强、重复性好,表明本研究所确定的反应体系适用于花椰菜的EST-SSR分子标记。     

华北蓝盆花ISSR-PCR引物筛选及反应体系优化

本研究以内蒙古自治区境内8个自然居群野生华北蓝盆花叶片作为供试材料,进行基因组总DNA的提取检测、ISSR引物筛选和引物退火温度的筛选。针对华北蓝盆花ISSR-PCR反应中的模板DNA浓度和引物浓度2个影响因素,在4个水平上对华北蓝盆花ISSR-PCR反应体系进行优化,确定最佳反应水平,最终建立华北蓝盆花ISSR-PCR扩增的最佳反应体系。结果筛选出了8条多态性较好的华北蓝盆花ISSR引物及其退火温度,平均每条ISSR引物扩增出12.3条带,多态性条带占93.88%;华北蓝盆花ISSR-PCR反应的最佳体系为总体积20μL,DNA模板1μL,DNA模板浓度为60 ng/μL,引物0.6μL,引物浓度为0.8μmol/L,Ex Taq DNA聚合酶10μL,ddH_2O 8.4μL,扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性0.5 min,不同引物最佳退火温度下退火1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环;循环结束后72℃继续延伸7 min;4℃保存。本研究结果为进一步研究华北蓝盆花居群遗传多样性提供科学依据。     

川续断ISSR反应体系的建立与优化

利用两轮混合均匀设计的方法,研究引物、2×Taq master mix、模板DNA以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响,在此基础上获得优化的川续断ISSR反应体系,为后续开展川续断的遗传多样性分析奠定基础。试验显示川续断ISSR-PCR最佳反应体系为:在18μL的反应体系中含有2×Taq Master Mix 10.44μL,模板DNA 45 ng,引物0.35μmol/L。在此基础上,从100条引物中筛选出5条扩增较稳定、多态性丰富的引物,随后进行的温度梯度PCR实验发现引物最佳退火温度介于45℃~58℃之间。该试验表明采用混合均匀设计和单因素试验相结合的方法,可以减少实验处理次数,快速建立ISSR反应体系,经过对9份川续断种质资源进行ISSR扩增检测,证明该体系稳定可靠,可用于川续断遗传多样性分析。     

藜芦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以藜芦为试验材料,通过L_(16)(4~5)正交试验与单因素实验两种方法对藜芦ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素(模板DNA,引物, Taq DNA聚合酶, dNTPs, Mg~(2+))进行筛选与优化,建立藜芦ISSR-PCR最佳反应体系;在此优化体系下,从100条引物中筛选适宜的ISSR引物,设置温度梯度检测各引物最佳退火温度。结果表明,藜芦20μL ISSR-PCR反应体系包括:0.30μmol/L引物、24 ng/20μL模板DNA、2 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTP、1.00 mmol/L Mg2+;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。利用14份藜芦样品验证该优化体系的稳定性,证明该体系稳定可靠,可为后续藜芦的遗传多样性分析研究提供帮助。     

玉米弯孢病病原菌ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为了对玉米弯孢病菌的鉴定、区域发生关系以及遗传多样性等进行研究,采用单因素试验优化玉米弯孢叶斑病菌ISSR-PCR反应体系中模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶、Mg~(2+)的用量,并确定每条引物的最佳退火温度。结果表明,最佳反应体系为:模板DNA 1.6μL(25 ng/μL)、引物1.4μL(5μmol/L)、dNTPs 0.25μL(2.5 mmol/L)、Taq酶0.4μL(2.5 U/μL)、Mg~(2+)0.8μL(25 mmol/L)、10×Taq Buffer 2μL、dd H2O 13.55μL。在该体系下选用3个玉米弯孢病菌的全基因组DNA,分别对52条ISSR引物进行筛选,筛选出16条多态性高、扩增稳定的ISSR引物。玉米弯孢病菌ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术对该病原菌进行遗传分析奠定了基础。     

柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的优化

为了获得最优柑橘黑斑病病原菌柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系,利用单因素试验法对反应体系中的5个因素(Mg2+、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)分别设置了不同的浓度梯度进行反应体系的优化。结果表明,在20μL反应体系中,含有1.5 mmol/L的Mg2+、0.15 mmol/L的d NTP、0.3μmol/L的引物、25 ng DNA模板、0.5 U Taq DNA聚合酶为最优。利用优化的ISSR-PCR反应体系对不同地理来源的21株柑橘叶点霉菌菌株进行扩增。结果表明,已建立的体系稳定可靠。柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术对柑橘叶点霉菌进行遗传分析奠定了基础。     

山羽藓ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用L16(45)正交试验设计法对山羽藓ISSR-PCR反应进行优化试验。研究结果表明,山羽藓ISSR-PCR最佳反应体系(25μL)为:Taq DNA聚合酶0.8 U,Mg2+1.5 mmol/L,d NTPs 0.4 mmol/L,引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,对该反应体系的影响顺序为:Taq DNA聚合酶引物d NTPs模板DNAMg2+。同时筛选出12条适合山羽藓的ISSR引物,并确定了每条引物的最适退火温度。所建立的体系稳定可靠,条带清晰且多态性丰富,可为后续开展山羽藓种植资源、遗传多样性及分子亲缘地理学研究奠定基础。     

大豆SSR技术反应体系的优化

以大豆为材料,研究了PCR反应体系的主要成分模板DNA浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq酶浓度及退火温度对大豆SSR扩增结果的影响,探索影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量及引物的退火温度。结果表明:在试验设计范围内,DNA浓度和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在0.05~0.2μmol/L范围内对扩增影响较小,Taq酶浓度对扩增有一定影响,引物要有其扩增适宜的退火温度。确立了适合大豆SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20μL,模板DNA 20 ng,dNTP 200μmol/L,引物0.15μmol/L,Taq酶0.5 U,10×Taq Buffer 1.5 mmol/L,ddH2O补至20μL。     

山莨菪ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以山莨菪为实验材料,通过正交设计与单因素两种试验方法对山莨菪ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA浓度,Mg2+,Taq酶,d NTPs及引物)进行4水平优化与筛选。经过PCR扩增结果的比较与分析,确定各因素的最适浓度,建立山莨菪的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明,25μL最佳反应体系为:3.0 mmol/L Mg2+、0.2 mol/L d NTPs、0.4μmol/L引物、0.5 U Taq DNA酶、40 ng DNA、2.5μL 10×Buffer。在最佳优化体系条件下,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,并确定各自最佳退火温度。建立的山莨菪ISSR-PCR反应体系,经过11份山莨菪样品检测,证明该体系稳定,可用于山莨菪遗传差异性分析。     

催吐萝芙木SRAP反应体系的优化及引物筛选

本研究以催吐萝芙木为材料,利用正交试验设计对影响SRAP-PCR反应的不同浓度模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物和d NTP进行优化,建立催吐萝芙木的SRAP-PCR最佳反应体系。20μL反应体系包括:10×Taq Plus Buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)2μL,d NTP 0.2 mmo1/L,Taq DNA聚合酶0.75 U,模板DNA 40 ng、正/反引物各1.2μmo1/L。在此条件下,对能够在催吐萝芙木、四叶萝芙、蛇根木、苏门答腊萝芙木、云南萝芙木中扩增的引物进行了筛选,获得30对具有通用性扩增的引物,为后续通过SRAP探讨其遗传多样性和亲缘关系方面的研究提供参考。     

万寿菊雄性不育系SRAP-PCR体系建立与优化

本研究以万寿菊雄性不育系2-2基因组DNA为试验材料,采用单因素和L16(45)正交设计对SRAPPCR反应体系的Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物和模板DNA浓度进行优化,以得到最佳的SRAP-PCR反应体系。结果表明最佳反应体系为:20μL体系中Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 0.3 mmol/L、Taq酶0.75 U、引物0.2μmol/L、模板DNA 80 ng。应用建立的反应体系对退火温度进行优化,得到两步退火温度分别为35℃和50.2℃。最后用9个万寿菊雄性不育两用系材料组对所得PCR体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,可为筛选与万寿菊雄性不育基因连锁的特异性标记奠定基础。     

枫香ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为探索最适的枫香叶片DNA提取方法、最优ISSR引物和最佳ISSR-PCR扩增反应体系,本试验采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法、高盐低pH法和试剂盒法提取枫香叶片DNA;采用三因素五水平(DNA模板用量,2×Taq Master Mix用量引物浓度)正交试验构建并优化枫香的ISSR-PCR反应体系;对100条ISSR引物进行筛选及其退火温度优化。结果表明：改良CTAB方法提取的DNA浓度高,且电泳条带清晰无污染;SDS和试剂盒方法提取DNA的浓度低,电泳条带亮度低;高盐低pH值法提取的DNA的电泳条带模糊且降解拖尾现象严重。DNA模板浓度为20 ng、Taq Master Mix用量为10μL、引物浓度为0.6μmol/L、ddH₂O为7.8μL时扩增程序的条带最清晰、多态性最好。筛选出17条重复性强、条带清晰明亮、多态性高的ISSR引物及其最适退火温度,其中扩增位点数最多的为引物UBC-834、UBC-836和UBC-853,扩增位点均为13个,以UBC-878为ISSR引物时的扩增反应中,当退火温度在46.9℃的时候能够扩...     

仁用杏ISSR分析体系的正交优化

本研究以仁用杏丰仁为试材,采用经改良的CTAB法提取实验材料幼叶基因组DNA.利用正交设计法,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq/DNA聚合酶及模板DNA用最5种因素4水平出发,构建和优化仁用杏ISSR-PCR反应体系,并采用直观分析和方差分析相结合的方法分析正交实验结果,最终建立了仁用杏ISSR-PCR最佳反应体系总体积20μL:1.5 U Taw DNA聚合酶、2.0 mmol/L MgCl_2、0.15 mmol/L dNTPs、0.35μmol/L引物、30～60 ng模板DNA.在优化体系的基础上筛选出 13个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定每个引物的最适退火温度.经对最佳反应体系和程序进行了验证,结果显示该体系具有扩增稳定性.     

淫羊藿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

本研究采用均匀设计和单因素试验相结合的方法,探寻淫羊藿ISSR-PCR的各组分(即引物, 2×Taq Master Mix,模板DNA)的最佳用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响,为进一步使用ISSR分子标记分析淫羊藿的遗传多样性提供科学依据。结果表明,筛选的最佳体系为:在20μL的体系中,模板DNA的量为30ng,2×Taq Master Mix的量为9.8μL,引物为0.325μmol/L。此外,筛选出7条多态性较好、条带稳定的引物(UBC-808, UBC814, UBC826, UBC827, UBC840, UBC846及UBC856),并对其进行温度梯度PCR,结果表明,所选引物的最佳退火温度介于46.8℃~65℃之间。在此基础上,对13份淫羊藿种质资源进行ISSR扩增验证,结果表明建立的最佳反应体系扩增效果较好,稳定性强,对淫羊藿的遗传多样性分析、鉴定等具有较好的应用价值。     

大赖草ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

本试验的目的在于建立大赖草最佳的ISSR-PCR反应体系。以大赖草基因组DNA为模板,利用单因子实验相结合正交试验设计的方法,对PCR体系的各因素(d NTPs,DNA及引物等)进行优化试验,同时筛选出扩增条带清晰、稳定性好的ISSR引物并确定其退火温度。试验表明,经优化后的PCR体系:在25μL体系中,DNA用量为50 ng、Taq DNA聚合酶用量为1.0 U、引物的浓度为0.4μmol/L、d NTPs的浓度为0.3 mmol/L、和Mg2+的浓度为2.5 mmol/L。体系验证试验表明该体系稳定、可靠,另外筛选出10条较好的引物,可用于后续的大赖草遗传多样性分析及亲缘关系分析、基因定位与克隆、连锁图谱构建等方面的研究,并对其它近缘作物有指导意义。     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA 聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR－PCR扩增的影响,建立了适合于金银花ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即在20 μL反应体系中,内含1×PCR反应缓冲液（Mg2＋free）、1.5 U Taq DNA 聚合酶、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.4 μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 MgCl2、60 ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为49.9 ℃。扩增程序为94 ℃预变性5 min ;35个循环为94 ℃变性30 s,49.9 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。利用优化反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这10条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。