水稻抗旱基因OsbHLH120 RNAi干扰载体的构建及遗传转化

OsbHLH120是一个参与非生物胁迫响应基因,与水稻的抗旱性密切相关。本研究根据RNAi表达载体设计原则,从水稻日本晴基因组DNA扩增OsbHLH120基因片段,将长度400 bp干扰目的片段通过正反两个方向与载体p TCK303连接。从pTCK303载体的启动子、终止子和Rice Itron结构中设计两对检测引物,直接将检测引物的PCR产物测序验证载体是否构建成功。通过农杆菌介导法将构建的OsbHLH120RNAi干扰表达载体导入水稻品种日本晴,获得18株转基因阳性苗。本研究结果将有利于进一步研究OsbHLH120在水稻抗旱过程中的作用。     

水稻OsBAK1P基因过表达与RNAi载体构建及其表型鉴定

为了探究水稻油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1前体物质OsBAK1P对水稻相关农艺性状的影响。通过以中花11粳稻品种为材料,根据基因所设计的特异性引物从水稻穗部cDNA中扩增得到CDS片段大小为651 bp的目的序列片段;通过酶切酶连的方法成功构建了PTCK303-OsBAK1P过表达载体和PTCK303-OsBAK1P RNA干扰载体;用农杆菌EHA105菌株转化表达正确的载体质粒并利用基因CDS扩增引物检测菌落筛选出阳性农杆菌克隆;再利用农杆菌遗传转化法侵染中花11粳稻品种的愈伤组织从而获得转基因植株;最后,相比较于中花11挑选2个表型相似的过表达、RNA干扰的T₁转基因植株测定并分析株高、穗长、叶夹角等农艺性状的变化和萌发初期的根长、胚芽鞘长度的变化以及对芸苔甾内酯(BL)的响应程度。结果表明,OE-OsBAK1P转基因水稻植株株高矮化,穗长变短,叶片夹角下降,种子萌发后根长增长而幼苗长度缩短,叶片对BL的响应不敏感;而RNAi-OsBAK1P转基因水稻植株株高增加,穗长变长,叶片夹角增加,种子萌发后根长缩短而幼苗长度增长,叶片对BL的响应敏感。综上,这些结果...     

甜菜BvWRKY23基因的RNAi载体构建

WRKY转录因子家族成员在调控植物生长发育、应答生物与非生物胁迫等方面具有重要的生物学功能。以抗旱甜菜（Beta vulgaris L.）幼苗为材料,提取叶片总RNA并反转录为cDNA,通过RT-PCR方法扩增获得甜菜WRKY转录因子家族成员BvWRKY23基因的RNAi靶片段,以中间载体PBSK-RTM作为媒介,利用传统的“酶切-连接”法构建了含有CaMV 35S启动子、BvWRKY23基因片段反向重复序列的RNAi（RNA interference）植物表达载体pCambia2301ky-BvWRKY23-RNAi。     

水稻育性调控相关基因RNAi载体的构建及其表型鉴定

利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。     

墨兰PI基因过表达载体构建及功能初步分析

MADS-box基因是植物中一类重要的转录调控因子,在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用,并参与花器官的发育和开花时间的调节。兰花中存在大量MADS基因,但这些基因的作用仅有少量研究报道。本研究将墨兰MADS基因家族中PI (PISTILLATA)基因cDNA开放框序列连接到pBWA(V)HU-ccdB-GUS载体上,构建了过表达载体,随后通过农杆菌介导法转化铁皮石斛原球茎,获得转基因株系;采用潮霉素抗性筛选,获得阳性植株,并利用试管开花技术,获得阳性植株开花苗,对开花表型进行观察。结果显示,PI基因在铁皮石斛中过表达能导致铁皮石斛花朵表型发生变化,阳性转化苗花朵在整体花型、中萼瓣和捧瓣的形状、花瓣边缘颜色、合蕊柱内侧的斑点区和紫色条带、舌瓣的颜色和形状等方面都发生了变异,尤其在舌瓣变化最明显,说明PI基因可能与兰花花瓣表型形成有关。本研究结果可为阐明墨兰舌瓣的形成机理及兰花基因工程育种性状改良提供参考依据。     

水稻细胞色素P450基因家族成员CYP81A6基因RNAi载体构建

水稻P450基因家族成员CYP81A6参与稻瘟病抗性反应,为了深入研究该基因的功能,本研究利用3次克隆的策略构建了该基因的RNAi载体。首先设计带有酶切位点的基因特异性引物,以c DNA为模板扩增3'非翻译区的特异片断,将目的产物连接到T载体上,经菌落PCR和酶切鉴定后进行测序。测序结果表示,目的片断已正确克隆到T载体上。然后利用双酶切通过2次亚克隆将目的片断以反向重复克隆到RNAi载体ds1301,通过分子检测表明,CYP81A6的RNAi载体构建成功,有助于后续的基因功能和作用机理的研究。     

亚麻MS2-F基因的RNAi表达载体构建

亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。     

水稻多胺转运蛋白OsPUT1基因RNAi载体的构建及遗传转化

在植物中,多胺(腐胺,亚精胺和精胺)参与许多生理过程,包括胚胎发育、器官形成、花芽发育,叶片衰老,花粉管生长、果实的发育和成熟,生物和非生物胁迫的响应。但是,PAS具有内在毒性和多重功能,细胞内的PA含量受到严格控制,受转运体的调节。因此,在水稻中研究水稻多胺转运蛋白OsPUT1的功能至关重要。本研究以水稻多胺转运蛋白基因OsPUT1为研究对象,通过构建OsPUT1-RNAi载体,借助根癌农杆菌介导水稻遗传转化,将OsPUT1的RNAi表达框转到水稻基因组中;经过PPT抗性筛选与PCR鉴定,成功获得了34株转基因水稻。对其中的7株转基因苗进一步作RT-PCR检测,显示有5株OsPUT1基因表达下调,实现了设计目标。这些转基因水稻为进一步研究OsPUT1的功能与作用机制提供了良好的遗传材料。     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

马铃薯RPP13基因RNAi载体的构建及遗传转化

RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析,发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关,应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析,选取其共同的保守区域作为沉默对象,构建了以该保守区域为臂,马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中,应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红,以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料,经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽,将再生植株进行PCR检测,筛选得到3株阳性转基因植株;以马铃薯的ef1a基因作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明：所获得的3株转基...     

水稻编码SAND结构域基因的序列与功能初步分析

为研究水稻SAND结构域蛋白的序列和功能,利用Blast在水稻基因组中搜索编码SAND结构域的基因,然后构建增强表达载体并通过遗传转化研究基因功能。结果表明,水稻基因LOC_Os01g57240(命名为OsULT1)编码的氨基酸序列含有SAND结构域和ULTB-box共有序列,与其他植物ULT氨基酸序列相似性为49.3%~92.3%,具有较好的保守性;35S::OsULT1转基因株系部分颖花发育异常,出现内稃发育滞缓或退化、浆片过度发育或数目变多、雄蕊数目3~7枚、雌蕊2枚的现象;颖花内产生多余的小花,表明OsULT1对水稻花分生组织正常分化具有重要的调控作用。     

小麦wx-B1a基因片段的克隆及其RNAi载体构建

为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段.Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene (GenBank NO:EU719611.1)同源.通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intronl (GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-Bl aIR.从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础.     

甘蔗ScPCaP1基因cDNA的克隆及RNAi载体的构建

拟南芥At PCa P1(protein bind calcium ions attaches to the plasma membrane,PCa P1)基因编码一个定位于细胞质膜上能结合钙离子且具有亲水性的跨膜蛋白,其参与协助了病毒粒子在植物胞间连丝中的运动,缺失该基因可导致芜菁花叶病毒在拟南芥中的累积量下降。本研究在甘蔗转录组数据库中搜索到与At PCa P1具有一定同源性的部分序列,并利用RACE(Rapid amplication of c DNA ends,RACE)技术从甘蔗品种台糖22的总RNA中克隆出完整的c DNA,命名为Sc PCa P1,Gen Bank收录号为KT891986。Sc PCa P1基因的c DNA全长为1 159 nt,5'端非编码区和3'端非编码区分别含有145 nt和312 nt,编码区包含一个702 nt的开放阅读框(Open reading frame,ORF),预测编码一个234个氨基酸的蛋白质,其分子量约为24.7 k D。同源性分析表明Sc PCa P1与拟南芥At PCa P1编码的蛋白的一致性为53.6%,与玉米和高粱的PCa P1蛋白一致性较高,分别是80.8%和85.2%。本研究进一步构建Sc PCa P1基因的RNAi(RNA interference)载体,用于后续研究Sc PCa P1在甘蔗抗病毒育种方面的作用及其他功能。     

马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)合成关系, 揭示sgt3基因在SGAs合成中的作用, 本研究根据GenBanK No：DQ266437保守区设计特异引物, 通过RT-PCR技术获得马铃薯块茎sgt3相似基因;采用生物信息学相关软件分析, 预测sgt3相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能, 构建基于sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的sgt3相似基因与报道的sgt3基因序列相似性达到99.54%, 其ORF长1 500 bp, 编码505个氨基酸残基, 具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为HM188447。以此为靶序列, 构建由Actin启动子和CIPP启动子驱动的与sgt1和sgt2基因相似度高的含有sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。     

玉米淀粉分支酶SBEⅠ基因RNAi干扰载体的构建

淀粉分支酶(SBE)催化葡萄糖以α-(1,6)糖苷键连接,形成分支结构。SBE有3种同工酶形式：SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb,目前的研究主要集中在SBEⅡb上,而对于SBEⅠ在淀粉合成的作用报道极少。为了明确SBEⅠ在玉米淀粉合成中的作用,扩增了玉米SBEⅠ基因的337 bp片段,以pMD19-T为中间载体,pCambia3301为目标载体,构建玉米SBEⅠ基因的RNAi载体,命名为pC3301-SBEⅠ。通过限制性内切酶酶切鉴定,表明pC3301-SBEⅠ载体构建正确,可用于农杆菌介导的玉米自交系转化工作。     

玉米ZmPT6基因的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法分别从玉米郑单958基因组DNA及RNA中克隆了菌根共生磷酸盐转运蛋白基因ZmPT6,序列分析表明,ZmPT6基因全长cDNA 1 665 bp,包括一个长97 bp的内含子;编码554个氨基酸,属于Pht1家族成员,由12个疏水的跨膜结构域组成.并构建了35S启动子驱动的植物正义、反义及RNAi表达载体,为下一步玉米的遗传转化及ZmPT6基因的功能研究奠定了基础.     

小麦wx-B1a基因片段的克隆及其RNAi载体构建

为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段。Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene(GenBank NO:EU719611.1)同源。通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intron1(GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-B1aIR。从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础。     

棉花胞质不育育性恢复候选基因载体构建及其功能初步分析

棉花细胞质雄性不育是研究杂种优势利用和质核互作机理的理想材料。本实验对棉花细胞质雄性不育育性恢复基因ZH46-3437利用pBI121载体构建了过表达载体。同时构建了amiRNA干扰载体即amiR3437,利用病毒诱导基因沉默体系pCLCrV浸染F1植株的子叶。转基因植株的相对荧光定量数据表明,amiR3437的相对表达量上调,而ZH46-3437的相对表达量下调,利用碘-碘化钾染色法鉴定转基因出现半不育性状,表明ZH46-3437基因可能与棉花花粉育性有关。