苦瓜种子蛋白质组双向电泳技术条件的优化

通过对苦瓜种子蛋白质样品的提取方法、等电聚焦参数、SDS-PAGE分离胶浓度以及胶条pH范围的优化筛选,建立了适合苦瓜种子蛋白组分析的双向电泳体系.结果表明:使用TCA-丙酮提取方法提取苦瓜种子蛋白,更适用于双向电泳分析,结合使用pH=5~8 IPG胶条以及优化的聚焦程序,能获得分辨率较高、蛋白点清晰、重复性好的2-DE图谱.经银染显色,可检测约660个蛋白点,主要分布在p H=5~8;该体系适合用于分析苦瓜种子的蛋白质组.     

水稻籽粒蛋白双向电泳条件的优化及其蛋白组学方法的比较

探讨适用于籽粒蛋白组学研究的策略,对深入研究籽粒的发育过程具有重要的意义。本文对比了3种不同的蛋白提取方法,优化了双向电泳中自制管胶一向的等电聚焦条件和IPG干胶条一向的等电聚焦时间,以MALDI-TOF/MS、Western-blot和磷酸化蛋白组学3个重要的蛋白质组学研究方法对胶内蛋白质鉴定分析。结果表明,可溶性蛋白提取法最适用于籽粒蛋白组学的研究; 电泳条件优化后,得到了较优的2-DE图谱; 胶内蛋白点适用于质谱分析、蛋白表达量验证(Western-blot)及籽粒蛋白的磷酸化组学的研究。本研究为下一步在蛋白组水平上分析籽粒发育提供了技术支持。     

百合总蛋白质提取及双向电泳技术体系优化

本研究以百合组培苗叶片为试验材料,研究不同蛋白提取方法的得率、电泳上样量及聚焦除盐时间对双向电泳图谱的影响。结果表明:采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取百合叶片蛋白质比Tris-HCl法效果好,蛋白得率为38.5 mg/g,且颜色较白,获得的2-DE图谱较好;上样量为600μg时得到的图谱分辨率高、蛋白斑点分布均匀、清晰;等电聚焦(Iso-electrofocusing,IEF)中的2个除盐步骤的时间分别为2 h和2.5 h时,可以较好地去除盐分,顺利完成聚焦并得到较好的双向电泳图谱。该体系的建立将为下一步百合蛋白质组学研究及利用分子育种技术培育抗病品种提供技术资料。     

萝卜蛋白组分析中叶片蛋白质高效提取方法

以萝卜‘NAU-JLQX09’叶片为材料,分别采用Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法和改进的PEG分级沉淀法提取蛋白质,通过双向凝胶电泳技术比较两种方法的效果.结果表明,应用Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白2-DE图谱可识别出640个蛋白点;而改进的PEG分级沉降法的蛋白组分(F1,F2以及F3) 2-DE图谱可清晰识别蛋白点数目分别为537,170与852,总蛋白点数目多且高丰度蛋白RuBisCO主要被沉降在F2中,F3中分离到更多的低丰度蛋白点.因此,在进行萝卜叶片蛋白质组分析时,采用PEG分级沉降法提取叶片蛋白,可获得较高质量的2-DE凝胶图谱.研究结果为应用蛋白质组学解析萝卜重要性状形成分子基础提供了良好的技术支持.     

圆果种黄麻功能叶总蛋白提取方法及双向电泳体系的优化

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。本文初步建立起一套适合圆果种黄麻功能叶总蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件,在双向电泳技术中,比较了TCA丙酮、Tris-base/丙酮、Tris-HCl的蛋白提取方法,并优化了上样量和样品制备方法。结果表明, TCA丙酮法提取蛋白质产量高,达79.0 mg g^–1,比Tris-base/丙酮法和Tris-HCl的产量分别高出44.2%和114.1%。该法得到的2-DE图谱背景清晰,蛋白点数最多,约602个,较其他两种方法更适合用于黄麻功能叶总蛋白双向电泳分析;350 mg为最佳上样量。这为黄麻蛋白质组学后续研究奠定了基础。     

刺参体腔液蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为了探索并建立刺参的体腔液蛋白双向电泳体系,实验对刺参体腔液的蛋白质制备方法、上样量、IPG 胶条的pH选择及等电聚焦程序进行了优化,并利用银染法进行染色。结果表明：改进的TCA-丙酮沉淀法增加了提取的蛋白量和纯度;采用8.5 cm,pH 4~6.5的IPG胶条,45 μg蛋白上样量,等电聚焦先设250 v电压,7 mA电流,聚焦时间30 min后,再将电压升至1000 v,聚焦时间3 h,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率。本实验可用于筛选刺参差异表达蛋白以及后续的刺参蛋白质组学研究。     

感染新型鸭呼肠孤病毒的番鸭肝脏蛋白质组双向电泳方法的建立

为建立感染新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的番鸭肝脏蛋白质组双向电泳(2-DE)方法。本研究通过对人工感染NDRV的雏番鸭肝脏病变的观察,对肝脏蛋白质提取裂解液的配方、样品上样量、一向等电聚焦(IEF)参数等条件的对比和优化,建立了有效的番鸭肝脏2-DE方法。结果表明：采用攻毒后病变最典型的第5天的番鸭肝脏作为研究样品;采用研磨-超声-裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、40 mmol/L Tris-base、0.5% IPG buffer）法提取肝脏蛋白质,结合2D clean-up kit以及去拖尾DeStreak试剂纯化蛋白,按1100 μg上样,设置IEF参数为：50 V 12 h、200 V 1.5 h、500 V 1 h、1000 V 1 h、8000 V 3 h、8000 V 60000 V h、500 V维持,采用胶体考马斯亮蓝染色,能获得分辨率高、重复性好的2-DE图谱。应用建立的2-DE方法和PDQest 8.0分析软件,发现26个与正常番鸭肝脏蛋白表达水平超过3倍的差异蛋白点。该方法的建立为进一步寻找NDRV感染宿主组织相关蛋白以及水禽呼肠孤病毒差异蛋白质组学研究提供了技术支持。     

燕窝蛋白质样品制备方法的比较及其双向电泳分析

燕窝水提及丙酮沉淀蛋白质经液相等电聚焦电泳纯化后,再经双向电泳分离获得了质量较佳的2-DE图谱,由此可见液相等电聚焦电泳是对燕窝蛋白质进行纯化的有效手段。对纯化后的2个白燕窝和1个血燕窝水提及丙酮沉淀蛋白质进行了双向电泳分析,结果显示两种方法制备蛋白质获得的2-DE图谱非常相似。燕窝水提蛋白质经丙酮沉淀制备样品时间较透析、冻干所需的时间短,这对于成分更为复杂且蛋白质提取率较低的血燕窝则更为适用。     

棉花叶片蛋白质组双向电泳技术的优化

 以棉花叶片为材料,针对试材中含有大量色素、酚、醌等干扰物质的问题,从蛋白提取方法、裂解液成分、上样量等方面对棉花叶片蛋白质组双向电泳技术进行优化。结果表明：采用改良的TCA/丙酮法提取棉花叶片总蛋白,含有7 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲、4% CHAPS、80 mmol·L^-1 DTT、1 mmol·L^-1 PMSF、0.3%载体两性电解质的裂解缓冲液,上样量为600 μg,采用pH 4～7、24 cm的IPG胶条进行双向电泳时,2-DE图谱的蛋白点分布均匀、清晰且重复性好。本体系为开展棉花蛋白质组学研究奠定了技术基础。     

毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质双向电泳体系的建立

为开展毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)的蛋白质组学研究,本研究对毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质提取方法和双向电泳参数进行了筛选和优化,以期建立适合毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳的实验体系。分别采用Tris-酚抽提法和TCA-丙酮法对毛尖紫萼藓总蛋白质进行提取,比较分析了两种蛋白质提取方法的效果,并研究了IPG胶条的pH范围及蛋白质电泳上样量等因素对毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳结果的影响。结果发现,在SDS-PAGE电泳结果中,与TCA-丙酮法相比,Tris-酚抽提法提取的蛋白质条带清晰,数目较多,完整性较好;在双向电泳结果中发现,与pH值为3~10的IPG胶条相比,使用pH值为4~7的IPG胶条的双向电泳图谱蛋白质点清晰且分布均匀,更适合毛尖紫萼藓的蛋白质组学分析;使用24 cm的pH值为4~7胶条,上样1200μg蛋白质时,电泳结果中可分辨的蛋白质点最多,且形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。本研究基于Tris-酚抽提法建立的毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳体系获得的蛋白质样品质量好,电泳分辨率高,为毛尖紫萼藓进一步的蛋白质组学研究提供理论参考。     

蓖麻RcPIPs基因家族的鉴定与生物信息学分析

PIP基因家族是AQP基因家族中的一个亚家族,家族基因广泛参与运输水分及其他小分子、响应各种非生物胁迫、参与植物的开花与生长、气孔活动、种子萌发。本研究主要以蓖麻(大戟科)为材料,基于蓖麻基因组数据库,进行蓖麻PIP基因家族筛选及生物信息学分析。结果表明,共筛选出10个PIP基因成员,且不同蛋白质序列和特性都存在较大差异;基因结构分析结果表明,除了RcPIP10具有3个外显子,其余的都具有4个外显子,motif 1、motif 2、motif 5、motif 8是蓖麻PIP基因的特征基序;系统进化树结果表明,RcPIPs基因分成2个亚族且每个亚族均有5个基因,其中有2对基因在进化关系上成对出现,表现出较高的同源性;跨膜结构预测结果表明,蛋白RcPIP1～RcPIP9均有6个跨膜结构域,而RcPIP10仅有4个跨膜结构域,证实蓖麻家族PIPs大部分具有MIP超家族典型的跨膜螺旋特征;基因定位显示,10个基因不均匀的分布到9条染色体上,有8条染色体各分布1个RcPIP基因,仅有1条染色体分布2个RcPIPs基因。本研究结果不仅为大戟科植物和其他植物的PIP基因的功能分析和利用提供了有价值的...     

秦艽种子蛋白粗提取研究

秦艽种子蛋白粗提取是电泳法快速检测秦艽种子质量的前提。本实验采用正交试验方法,对提取过程中的料液比、缓冲液类型与pH、浸提时间、浸提液、PVP用量、SDS等主要影响因素进行了研究。初步确定在低温条件(4℃)下,秦艽种子蛋白提取较佳条件为:料液比1∶10,pH值8.0的0.05 mol/L Tris-HCl(1%DTT)缓冲液,浸提时间1 h;并且在这种条件下秦艽种子提取的谷蛋白最多。     

叶用莴苣叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

为建立适用于生菜的(Lactuca sative L.)蛋白质组研究的双向电泳技术(2-DE),以叶用莴苣S24为材料, 采用TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白,比较了两种标准曲线对蛋白浓度测定的影响,同时探讨了蛋白裂解、等电聚焦(IEF)条件以及其他一些关键技术,结果显示：与传统标准曲线相比,采用改良后标准曲线测定的蛋白浓度更准确,得到了背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。初步建立了叶用莴苣叶片蛋白质的双向电泳技术(2-DE)体系。     

柱花草RAPD品种鉴定方法

针对柱花草不易从种子表型进行品种区分、品种真实性缺乏有效的早期鉴定技术,尝试建立柱花草种子RAPD品种鉴别方法.选取11个柱花草品种,采用改良的CTAB法从种子中提取总DNA.在优化的RAPD反应条件下,从100条随机引物中筛选出4条构建指纹图谱.4条引物总扩增带45条,其中多态性带42条,多态带比率达93.3%.通过聚类分析,对指纹图谱进行可靠性评估.11个品种的聚类情况与其亲缘关系相符合,表明依据图谱上的DNA带进行品种鉴定是可信的.本研究首次为柱花草种子的品种鉴定提供了完整的分子标记检测方法.     

IPGphorTM等电聚焦加样方法的改进与电泳结果的预测

固相pH梯度干胶条等电聚焦电泳技术因其分辨率高而成为当今双向电泳分离蛋白质的首选技术,但其实验步骤多难度大,要求试剂配制精确,各项操作无误。通过改变蛋白质加样方法,测定固相pH梯度干胶条IEF电泳过程中的前期水化干胶条时初始电流与终电压的内在规律,发现在不同的样品和不同的设定电压条件下初始电流的变化与IEF电泳终电压结果存在着高度的相关性,水化干胶条时的初始电流与终电压亦存在着高度的相关性。将IEF电泳的水化初始电流值(1μA)作为蛋白质等电聚焦判断标准,指导实验。其方法实用简便,可提高工作效率。     

蓖麻NAC转录因子家族的鉴定及生物信息学分析

NAC蛋白是植物特有的转录因子大家族,作用于植物生长发育和逆境胁迫响应,本研究基于蓖麻全基因组数据,利用生物信息学分析方法对蓖麻NAC转录因子家族成员、系统发育、编码蛋白的结构和理化性质进行分析。蓖麻NAC转录因子家族包括91个成员,分为14个亚族,其中蓖麻NAC转录因子Ⅻ亚族和Ⅻ亚族为蓖麻特有NAC蛋白;基因结构分析显示内含子数量为2~5个,Ⅻ亚族中12个成员缺少内含子;蛋白结构域分析显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个亚族蛋白质序列5个结构域(Motif)保守性较强,motif 2几乎存在所有蓖麻NAC蛋白中;与拟南芥105个NAC成员构建系统发育进化树,蓖麻58个NAC蛋白分别聚类到38个OGs,NAC转录因子的40个OGs中蓖麻缺少OG3b和OG7f;理化性质和结构分析显示蓖麻NAC蛋白质绝大多数是亲水氨基酸,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构大部分相似。蓖麻具有很强的抗逆境胁迫能力,本研究为蓖麻耐性相关的NAC转录因子调控机理研究提供了科学依据。     

薏米蛋白提取及其SDS-PAGE电泳分析

为了提高薏米蛋白的提取得率,确定提取pH、料液比、提取温度、提取时间对蛋白提取率的影响,进一步得到薏米蛋白SDS-PAGE电泳图谱。采用碱法提取薏米蛋白,通过响应面回归分析,得到碱法提取薏米蛋白的优化工艺条件并且进行SDS-PAGE凝胶电泳分析薏米蛋白电泳图谱。结果表明,碱法提取薏米蛋白的优化工艺条件为料液比为1:11.8,提取时间4.93 h,提取温度为35℃,提取pH 10.47。在最优条件下,薏米蛋白提取率达到43.94%。薏米蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析,薏米蛋白电泳图谱共分离出2条蛋白亚基条带,较大薏米蛋白亚基分子量143 kD,较小薏米蛋白亚基分子量为85 kD。通过响应面碱法提取薏米蛋白,提取率明显提高,采用SDS-PAGE法对薏米蛋白进行分析,为构建薏米蛋白质指纹图谱提供理论依据。     

甘草种子蛋白质提取及SDS-PAGE电泳技术研究

目的:建立一套适用于甘草种子蛋白质提取及SDS-PAGE电泳的技术体系,为甘草种子纯度检测提供技术支撑.方法:对甘草种子蛋白质的8种提取方法进行了筛选,在此基础上进一步比较不同的分离胶浓度、不同料液比对甘草种子蛋白质SDS-PAGE电泳的影响,并采用该技术方法对乌拉尔甘草和胀果甘草种子进行鉴定.结果:巯基乙醇法和丙酮沉淀法是适宜的蛋白质提取方法,巯基乙醇法得到12条带,丙酮沉淀法得到9条蛋白质条带,且背景颜色较浅,适宜于进行种子纯度检测.10％分离胶和1∶10的料液比电泳效果较好.乌拉尔甘草和胀果甘草种子有蛋白质条带的差异.结论:建立了一种高质量的甘草种子蛋白质样品的制备方法及SDS-PAGE电泳技术,可用于甘草种子纯度检测.     

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。     

酸溶蛋白质电泳方法鉴定小麦种子纯度

本试验通过对小麦种子酸溶蛋白质的提取液浓度、提取时间和电泳凝胶组分浓度进行研究,建立了一种对小麦种子纯度进行鉴定的常规电泳技术方法.结果表明该方法具有以下特点:①样品提取时间短;②蛋白质组分多态性丰富;③电泳谱带清晰,分辨率高.