日本结缕草ZjSPL4基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

根据转录组数据库,通过同源克隆获得结缕草ZjSPL4基因,开放阅读框为1 002 bp,编码333个氨基酸,该基因具有SBP基因家族保守域。ZjSPL4编码的蛋白分子量为36.381 63 k D,理论等电点(pI)为8.79,总平均亲水性为-0.707,属于亲水性蛋白。二级结构预测结果显示ZjSPL4蛋白主要由无规则卷曲(Cc)、α螺旋(Hh)构成。ZjSPL4蛋白与其他植物的SBP蛋白总体相似度为53.71%,通过系统进化树分析发现ZjSPL4与谷子和二穗短柄草中的SPL基因亲缘关系较近。ZjSPL4蛋白亚细胞定位结果显示,其编码的蛋白定位于细胞核中。同时日本结缕草ZjSPL4基因受到GA、ABA、蔗糖、低温的诱导,说明该基因可能参与结缕草花芽分化以及抗逆反应等过程。因此,克隆分析结缕草ZjSPL4基因可为结缕草花芽分化与抗性机制研究以及分子育种提供一定参考。     

红花(Carthamus tinctorius)热激转录因子CtHSFA9的克隆及表达分析

根据课题组前期转录组文库信息获得的红花热胁迫相关转录因子Unigene的全长序列,设计引物并克隆该基因,采用生物信息学方法对其氨基酸序列的理化性质、系统发育、蛋白质亚细胞定位、结构域及跨膜区域等进行预测和分析。此外,试验还采用RT-qPCR方法分析该基因在红花各组织包括根、茎、叶、花及4个不同发育时期的种子中的表达情况。结果发现,所获序列全长1 326 bp,可编码441个氨基酸,相对分子质量50.41 k D。其中,最丰富的氨基酸为亮氨酸(Leu),带正电残基64个,带负电残基75个。信号肽及亚细胞定位揭示该基因不存在明显信号肽且该基因属细胞核定位。SMART分析表明该基因具有典型HSF结构域。进化树分析表明,该序列与热激转录因子HSFA9基因相似度较高,与刺菜蓟的亲缘关系最近,因此可将其命名为CtHSFA9。荧光定量PCR分析表明CtHSFA9基因在红花根组织中相对表达量最高,叶次之,花中最低。在不同发育时期种子中,以花后18 DAF (Day after flower)中表达量最高,22 DAF次之,在14 DAF表达量最低。本研究初步明确了红花CtHSFA9基因的结构特点和进化关系,其属于HSF热激转录因子家族,可为后续开展红花逆境相关转录因子的机理研究做铺垫,同时也为植物抗逆性状的改良提供研究基础。     

日本结缕草ZjLEA3基因克隆、亚细胞定位及表达分析

为了研究日本结缕草抗逆机制,本研究以日本结缕草(Zoysia japonica)转录组的数据为基础,克隆得到ZjLEA3基因,其开放阅读框为555 bp,编码184个氨基酸。ZjLEA3基因包含LEA基因族保守区域,与其他植物LEA基因相似度在65.79%以上。软件分析表明该蛋白属于小分子亲水性蛋白;亚细胞定位结果显示该基因编码的蛋白定位于细胞质和细胞核中;ZjLEA3表达分析表明,该基因是受到了高温、高盐、PEG的诱导,由此推断ZjLEA3可能参与非生物胁迫的防御。本试验克隆并分析ZjLEA3基因是为日本结缕草抗逆机理研究提供帮助。     

草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT1/PTR FAMILY 5.8基因的克隆及生物信息学分析

硝态氮是植物主要的氮素营养来源,与植物的生长发育与抗性能力密切相关。硝态氮的吸收与运转对提高植物氮素利用效率有调控作用,其中硝酸盐转运蛋白发挥重要作用。本研究通过RT-PCR的方法克隆得到草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT1/PTR FAMILY 5.8基因的编码区序列,并进行生物信息学分析。结果表明,该基因编码区长度为1 434 bp,共编码477个氨基酸。NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白分子量为51.7 kD,等电点为4.9。NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白共有8个跨膜结构域,3个糖基化,位点无信号肽,预测定位于质膜或内质网中。NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白含有结构域PTR2属于MFS蛋白超家族。草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白与二穗短柄草,粗山羊草的相似度较高,而且不同物种之间的NRT1/PTR FAMILY 5.8与NRT1/PTR FAMILY 5.9的同源进化关系较近。本研究为进一步研究NRT1/PTR FAMILY 5.8基因的功能及硝酸盐转运途径具有重要意义。     

芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

森林草莓FvSPL2基因克隆、过表达载体构建及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)转录因子是植物特有的一类基因家族,广泛存在于高等植物中,在植物营养生长和生殖发育中起着重要的调控作用。为了探究SPL基因对森林草莓(Fragaria vesca)花发育的影响,本研究以森林草莓‘Hawaii4’为试验材料,基于森林草莓转录组数据分析,克隆得到SPL转录因子基因FvSPL2,对其进行生物信息学和表达分析,并构建了35S::FvSPL2过表达载体。结果表明：FvSPL2基因编码区全长639 bp,编码212个氨基酸;蛋白质理化性质和结构分析表明FvSPL2蛋白为不稳定亲水性蛋白,其含有高度保守的SBP结构域和一个核定位信号NLS。RT-qPCR分析结果显示FvSPL2基因在花中表达量最高,在叶柄和叶片中次之。此外,该基因在不同花期表达先上升后下降,在半开花中表达量最高,且与花苞和全开花差异显著。这些结果说明该基因主要参与开花调控过程。研究结果为后续研究FvSPL2基因在森林草莓中的生物学功能提供数据依据。     

马铃薯光敏色素作用因子基因PIF4的克隆及表达分析

本研究以栽培种马铃薯青薯9号为试验材料,利用同源克隆技术分离出一个光敏色素作用因子St PIF4基因,该基因开放阅读框长度为1 554 bp,编码517个氨基酸,含有HLH保守结构域;系统进化树分析表明,StPIF4与茄科植物聚为一类,和已测序的马铃薯DM亲缘关系最近。蛋白功能预测表明,StPIF4蛋白不具备信号肽位点和跨膜结构,其蛋白序列含有56个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞核或细胞质中。RT-qPCR分析表明,StPIF4在根、茎、叶片、块茎和匍匐茎中均能表达,在叶片中相对表达量最高,根中较低。通过对StPIF4基因的克隆和表达分析,为深入马铃薯StPIF4的功能分析提供科学基础。     

香蕉MaMYBR1基因的克隆和表达分析

为研究MaMYBR1基因参与香蕉响应的胁迫过程,本研究利用RT-PCR获得香蕉MaMYBR1基因的全长,包含786个核苷酸,编码261个氨基酸。将该基因核苷酸序列在NCBI进行BLASTn比对,发现该基因与大麦(AK359880)、花药野生稻(XM_015836768.1)和小麦(AB252147.1)的基因序列具有较高的相似度,相似度分别为80.06%、79.19%和79.19%。蛋白结构域分析发现该基因编码的蛋白质序列包含有一个MYB结构域和一个SANT结构域。系统进化树分析表明,该蛋白与海枣(XP_008785342.1)和油棕(XP_010920477.1)等植物亲缘关系较近。通过实时荧光定量PCR分析表明MaMYBR1以上调表达模式参与香蕉响应低温、干旱和盐等胁迫过程,其中在低温胁迫下MaMYBR1基因的相对表达量变化最大;MaMYBR1基因在接种枯萎病菌的抗病品种中显著上调表达,而在感病品种中显著下调表达,MaMYBR1基因可能参与香蕉抗枯萎病过程。因此,本研究将为后续香蕉遗传改良提供有价值的研究信息。     

中间锦鸡儿CiWRKY2基因克隆与表达分析

通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆得到一个WRKY转录因子编码基因CiWRKY2,该基因g DNA为3 224 bp,含有4个内含子;cDNA长2 032 bp,开放阅读框1 725 bp,可以编码574个氨基酸,蛋白分子量大小约为63.29 kD,等电点为7.65。系统进化分析发现,CiWRKY2与豆科植物WRKY相似度最高,属于第一类WRKY蛋白。亚细胞定位显示CiWRKY2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量结果表明CiWRKY2主要在叶、根中表达,并且该基因转录水平的表达受到干旱、盐碱、高温、低温和ABA诱导,表明CiWRKY2基因可能在植物抗逆中起到一定作用。     

马铃薯StGS基因克隆及镉胁迫下的表达分析

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是植物体内重要的抗氧化剂,能有效清除活性氧自由基对细胞造成的损伤。为研究镉胁迫对马铃薯(Solanum tuberosum)谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase, GS)编码基因表达的影响,本研究以马铃薯‘威芋7号’为试验材料,采用同源克隆的方法从cDNA中克隆到StGS基因。序列分析表明,该基因ORF全长为1 644 bp,可编码344个氨基酸;在所选的物种中,蛋白序列同源性分析显示,马铃薯GS蛋白与潘那利番茄(Solanum pennellii)的亲缘关系最近,相似度为93.98%,与枸杞(Lycium barbarum)亲缘关系最远。另外,实时荧光定量PCR分析表明,镉胁迫24 h与4 h相比,马铃薯根和叶中GS相对表达量均达到极显著水平,分别为胁迫4 h的15倍和13倍;而在茎中GS相对表达量呈现出下降趋势。镉胁迫4 h时GS相对表达量为24 h的6倍,暗示StGS不仅是一个镉应答的基因,而且马铃薯植株不同器官应在应答镉胁迫时GS的表达存在一定差异。本研究结果为进一步探究StGS基因介导的镉胁迫响应机制提供前期基础。     

牡丹PsSPL3基因的克隆和表达特性分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)转录因子在植物多个生理过程中发挥重要的生理功能,为了研究其在牡丹花芽休眠进程中的作用机理,采用RACE方法,从牡丹花芽中克隆得到了一个SPL基因。该基因全长cDNA 1 057 bp,完整开放阅读框为549 bp,编码182个氨基酸,Blast分析表明,编码的氨基酸序列中具有SBP-box基因家族所特有的SBP-box保守结构域。与拟南芥已知SPLs蛋白构建进化树结果表明,牡丹SPL蛋白与At SPL3聚为一支,该基因被命名为PsSPL3。生物软件预测PsSPL3蛋白分子量为20.349 4 kDa,理论等电点为9.62。同源性分析了牡丹PsSPL3与其他已知植物的SPL3,相似性为47.98%~69.46%,其中与白桦的SPL3蛋白相似性最高,为69.46%。实时定量PCR分析PsSPL3基因在初花期牡丹不同组织中和花芽休眠过程中的表达水平,结果表明,PsSPL3基因在不同组织中表达差异较大,其中在根中转录水平最高,在茎和花瓣中次之;PsSPL3基因在休眠进程中的转录水平呈先上升后下降趋势,其中低温处理14 d时,PsSPL3基因的表达量达到最高。低温7 d结合外源施加GA3的牡丹花芽中PsSPL3基因的表达量显著增加,推测PsSPL3基因的转录受GA3诱导来促进牡丹花芽内休眠解除的进程。     

黄瓜SBP家族基因鉴定与表达分析

SQUAMOSA启动子结合蛋白家族(SBP家族)是植物中特有的一类转录因子,在植物生长发育中发挥重要作用。本研究通过生物信息学方法从黄瓜基因组中鉴定出15个SBP基因,并对这些基因的理化性质、基因结构、系统进化以及不同组织中的表达进行了分析。结果显示黄瓜15个CsSBP基因分布于4条染色体上,分为6个类群,同一个类群中的基因具有相似基因结构和保守基序。表达分析表明。CsSBP9、CsSBP12、CsSBP10、CsSBP3、CsSBP8和CsSBP7在所有组织中都有表达,其余基因在特定组织中表达量比较高,暗示SBP基因在黄瓜生长发育的不同阶段都扮演了重要角色。本研究为进一步鉴定黄瓜SBP基因功能奠定了一定基础。     

‘西伯利亚’百合LiMCT基因的克隆及表达特性分析

2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase, MCT)是单萜合成途径中的关键酶。为揭示其在‘西伯利亚’百合(Lilium'Siberia')中的作用,明确其表达模式,本试验克隆了‘西伯利亚’百合LiMCT基因,进行同源氨基酸序列的多重比对,生物信息学分析及亚细胞定位。最后采用荧光定量PCR技术(RT-qPCR)对该基因进行时空表达分析。结果表明,LiMCT基因开放阅读框为897 bp,编码298个氨基酸,与日本樱花、蔓花生、小兰屿蝴蝶兰、莴苣、铁皮石斛的MCT蛋白相似度较高。LiMCT蛋白定位在拟南芥原生质体的细胞膜中。在不同花期中,LiMCT基因表达量在半开期和盛开期最高,花蕾期最低。在不同花器官组织中,LiMCT基因在花柱中表达最高,外花被片和花药中较多,在其他部位表达较低。本研究探究了LiMCT蛋白的结构功能及其基因在开花期的时空表达模式,为其在‘西伯利亚’百合单萜合成及其花香释放的调控机制提供科学依据。     

陆地棉GhSPL3基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 利用生物信息学结合RT-PCR技术从陆地棉中克隆出SPL转录因子,命名为GhSPL3,在GenBank的登录号为JN795132。该基因包含一个426 bp的ORF(开放阅读框),推测编码141个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明GhSPL3包含一个典型的SBP结构域和一个核定位信号;进化树分析发现,GhSPL3与AtSPL3聚为一组,推测棉花GhSPL3和拟南芥AtSPL3在结构和功能上可能有着一定的相似性。亚细胞定位表明,GhSPL3定位于细胞核中,荧光定量RT-PCR结果表明,GhSPL3基因在棉花各组织中都有表达,但表达量不同。在花中表达量最高,其次是在顶芽和茎中的表达量,在根和叶中表达量较低。通过分析GhSPL3在顶芽的不同发育时期的表达量发现,GhSPL3在三片真叶展平时的顶芽中表达量最高,推测GhSPL3可能在花芽的分化、生长阶段的转变和花器官的形成上起着重要作用。     

大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析

采用基因芯片技术,从大豆中鉴定了一个荚优势表达基因。利用生物信息学的方法,拼接了该基因的全长序列,并通过RT-PCR克隆了该基因。Blast检索分析表明,该基因编码一个具有AP2结构域的转录因子,且与拟南芥DREB类蛋白TINY的氨基酸相似度最高,将该基因命名为GmTINY1。GmTINY1包含一个735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸残基。GmTINY1与拟南芥TINY和TINY2蛋白的相似度分别为59%与62%。系统发生分析表明,GmTINY1、TINY和TINY2位于一个分支,且同属于DREB亚家族。实时定量RT-PCR检测表明,GmTINY1基因在荚中高丰度表达,在花中的表达量也较高,在根中的表达量较低,而在叶片中未检测到表达。基因芯片信息分析结果表明,GmTINY1在种子发育的子叶期的种脐部分高丰度表达。由此推论,GmTINY1基因在大豆生殖器官发育中可能发挥调控作用,可能与种子发育过程中种脐的形成有关。     

大豆GmGBPl在GA调控开花过程中的功能分析

从大豆中克隆得到一个编码SKIP蛋白的基因,命名为GmGBPl。通过研究外施赤霉素对GmGBPl过表达拟南芥植株表型及相关基因表达量的影响,探讨了该基因在GA3调控开花过程中的功能。结果表明,过表达GmGBPl植株对赤霉素的敏感性加强,植株开花时间显著提早,开花相关基因的相对表达量明显提高,而与野生型相比,GA3生物合成途径关键酶基因GA3ox和GA20ox的相对表达量下降明显。初步证实GmGBPl为GA开花信号途径中的正向调控因子,负调节植物赤霉素的生物合成。     

苹果矮化砧木GA20氧化酶基因的克隆及其表达分析

为了研究GA20氧化酶基因在苹果矮化砧木中的分子特征和表达特征,利用RT-PCR方法从苹果矮化砧木2号和36号c DNA中克隆了GA20氧化酶基因(GA20ox1),并对该基因及其编码氨基酸序列以及在不同时期砧木及嫁接品种中的表达分别进行了分析。结果表明,GA20ox1基因c DNA编码序列长1 179 bp,推导编码393个氨基酸(包括终止密码子),预测蛋白相对分子质量44.3 k Da,理论等电点5.89,编码的蛋白质包含GA20ox1基因家族所具有的特征保守结构域,系统进化分析表明该蛋白序列与苹果SH40的同源性达到96.9%。实时荧光定量PCR分析显示:36号砧木在6月份GA20ox1基因表达强度显著低于八棱海棠对照,而7-8月份的均显著高于对照,其上嫁接的品种7月份表达强度显著低于对照。在7-8月份2号砧木及嫁接品种GA20ox1基因的表达强度均显著低于对照。     

柠檬F-box基因的克隆及表达分析

本研究以香水柠檬幼嫩叶片为材料,在前期通过De Novo技术获得的F-box基因片段基础上设计引物,利用RT-PCR技术成功克隆出长度为585 bp的F-box基因,命名为LFB1,该基因编码194个氨基酸,该氨基酸序列在N端具有F-box结构域,生物信息学分析表明:该蛋白分子量为48.94 k D,等电点:5.2。进化分析发现其与克里曼丁桔(Citrus clementina)聚在一起。q RT-PCR分析表明:该基因在植株的根、茎、嫩叶、老叶、花蕾、花苞、幼果、成熟果中均有表达,LFB1基因在组织中的表达量是:茎老叶根花蕾成熟果嫩叶幼果;在花的不同器官的表达分析,发现该基因在雄蕊中的表达量最高,其它组织则相对较低,在雄蕊中基因的表达量是其它组织的10倍左右;在逆境胁迫下,该基因的表达量发生明显变化,表明该基因与植株的生长发育、花粉的发育以及环境胁迫可能有着一定的关系。     

猕猴桃AcWRKY70基因序列克隆及其对溃疡病病原菌和激素处理表达模式分析

为探究猕猴桃AcWRKY70转录因子在不同抗病性品种中响应猕猴桃溃疡病胁迫的作用机制,以抗性病品种徐香和高感病品种红阳猕猴桃叶片cDNA为模板克隆AcWRKY70基因,并对红阳AcWRKY70基因序列特征进行分析,对编码蛋白进行系统进化分析及亚细胞定位预测。通过RT-qPCR分析AcWRKY70基因的组织特异性,不同抗性猕猴桃品种对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Psa)和水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)处理下表达模式的差异。结果显示,红阳AcWRKY70基因序列总长906 bp(GenBank登录号：MW881147),开放阅读框885 bp,编码294个氨基酸;含有典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为C2-HC,属于WRKY家族第Ⅲ类组,亚细胞定位预测表明,其定位于细胞核,系统进化树分析表明,其与茶树亲缘关系最近。红阳和徐香AcWRKY70基因均在叶片中表达量最高。在Psa处理下,12 h徐香品种AcWRKY70基因相对表达量迅速上升至对照的80.58倍;而在红阳中48 h该基因相对表达水平上升至最高。在SA与Psa(SA+Psa)和MeJA与Psa(MeJA+Psa)共...     

秦川牛CDS1基因克隆、分子特征及组织表达分析

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点，以秦川牛为研究对象，利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列，利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征，以GAPDH为内参基因，采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示，秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸，CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性，且与瘤牛的同源性最高；CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白，主要由α-螺旋及不规则卷曲构成；亚细胞定位分析表明，CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体；蛋白互作分析表明，其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用，提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程；组织表达分析表明，CDS1基因在各个组织均有广泛表达，且在睾丸中表达量最高，在脑的表达水平也较高，二者均显著高于其他组织的表达水平，在心的表达量最低。