蒜芥茄黄萎病抗性相关基因SsWRKY22和SsWRKY33的克隆与表达分析

黄萎病是茄子生产中的重要病害之一,严重影响茄子的产量和品质。WRKY转录因子在植物抗病中扮演着重要的角色,但在茄子黄萎病抗性中的作用不明。本研究从黄萎病高抗材料野生蒜芥茄的转录组数据中,筛选获得WRKY家族中的SsWRKY22和SsWRKY33基因,利用PCR技术克隆获得目的基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明,SsWRKY22和SsWRKY33基因的ORF序列大小分别为528和1 073 bp,编码175个和357个氨基酸;蛋白分子量分别为19.19和40.46 kD,均属于亲水性不稳定蛋白,其中,Ss WRKY22编码的蛋白属于酸性蛋白,而Ss WRKY33编码的蛋白属于碱性蛋白,亚细胞定位预测两个基因编码的蛋白均定位于细胞核上;此外,SsWRKY22和SsWRKY33分别属于Ⅱ类和Ⅰ类WRKY转录因子,具有不同的蛋白结构。系统发育分析结果表明,Ss WRKY22与野生潘那利番茄、番茄和马铃薯中的WRKY22亲缘关系较近;而Ss WRKY33与辣椒中的WRKY33亲缘关系最近。利用RT-qPCR对SsWRKY22和SsWRKY33基因在蒜芥茄不同部位(根,茎,叶)的表...     

芸芥中DnaJ同源基因的克隆与表达分析

为研究芸芥自交亲和机理,采用mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析技术,从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得1条差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明,该差异片段与拟南芥DnaJ蛋白同源基因At J3有较高同源性,暂命名为esAtJ3基因。该序列含有一个长度为297 bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJ-C保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因编码的蛋白无信号肽,是一个亲水性蛋白,该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量PCR分析表明,esAtJ3基因在芸芥SC系开花前柱头中表达量较高,初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。     

大蒜芥SaPOD基因的克隆及序列分析响

过氧化物酶(POD)是植物生长发育过程中调控生物体代谢及细胞抵御活性氧伤害的关键基因酶。本研究利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到大蒜芥POD基因Sa POD全长c DNA序列。该基因全长1 315 bp,其中开放阅读框为975 bp,编码含有325个氨基酸,预测编码蛋白质的等电点为4.94,分子量为109.62 k D。Sa POD与小盐芥、拟南芥、荠菜、琴叶拟南芥、盐芥、棉花和蓖麻子的POD蛋白质序列相似性分别为96%、92%、92%、91%、78%、74%和75%,说明该基因与POD同源。Sa POD基因的克隆将为进一步基因的功能分析奠定基础。     

野生茄托鲁巴姆抗根结线虫相关基因的克隆与表达分析

克隆茄子抗根结线虫相关基因并利用荧光定量PCR技术分析其表达特性。根据在NCBI上找到的抗性基因NBS-LRR保守结构域,设计简并引物,以野生茄托鲁巴姆(Solanum torvum Swartz)的c DNA为模板采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆抗根结线虫基因,利用荧光定量PCR技术分析其表达特性。获得15条抗性基因片段,且E1、E3、E6、E7、E12、E13、E15为茄子抗根结线虫基因片段。通过聚类分析和氨基酸比对确定E7为Mi基因的一部分。利用RACE技术获得到了野生茄托鲁巴姆抗根结线虫Mi同源基因序列。本研究在野生茄托鲁巴姆中获得了抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs)基因,为茄子抗根结线虫分子育种奠定基础。     

盐芥耐盐相关基因的克隆

盐芥是极端耐盐的十字花科植物，由于有着与拟南芥相似的多种优点(基因组小、生活史短、产种子多、容易转化等)，小盐芥被认为是研究植物耐盐机理的模式盐生植物。我们以裂殖酵母为一简单的功能体系，通过盐芥基因在酵母细胞中过量表达对酵母耐盐性的影响，分离鉴定了多个耐盐相关基因(如GIP-结合蛋白基因，     

香椿TsCCR基因的克隆及表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是木质素合成的关键酶,本研究根据香椿转录组数据从太和‘红油椿’中克隆得到1个肉桂酰辅酶A还原酶基因,命名为TsCCR,对其进行了生物信息学分析,并通过荧光定量PCR技术分析了TsCCR基因在香椿幼苗根、茎、叶及低温、高温、干旱、盐4种非生物胁迫条件下的表达特性。结果表明:香椿TsCCR基因含有975 bp的开放阅读框,共编码324个氨基酸,含有FR-SDR-e保守结构域,与柑橘的亲缘关系最近;TsCCR基因在茎中的表达量最高;4℃低温胁迫期间,TsCCR表达量短暂升高后逐渐降低;38℃高温胁迫期间,短暂降低后逐渐升高;200 mmol/L NaCl盐胁迫处理期间,TsCCR表达量在4 h时急剧降低,随后又急剧增加;200 g/L PEG6000干旱胁迫处理期间,TsCCR表达量呈现先下降后升高又下降的趋势。以上结果表明香椿TsCCR基因在香椿抵抗非生物胁迫方面可能发挥调控作用,本试验结果为通过基因工程改良香椿的栽培抗性提供了参考。     

石蒜LrCMO基因的克隆及表达分析

以石蒜(Lycoris radiata)为试材,采用同源克隆和RACE的试验方法,克隆得到LrCMO基因全长cDNA,并对其进行了基因表达分析。结果表明:LrCMO基因全长1 472 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 281 bp,编码427个氨基酸残基,预测编码蛋白质的分子量为47.92 kD,理论等电点为5.72;LrCMO是一个稳定的疏水蛋白,不具有跨膜结构,含有叶绿体导肽;LrCMO基因编码的氨基酸与植物其他CMO蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdCMO、香蕉MaCMO及油棕EgCMO亲缘关系最高,聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,LrCMO在根、鳞茎和叶片中有表达,且在鳞茎中的表达量最高;LrCMO受聚乙二醇(PEG)处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后12 h达到最高。随着处理时间的延长,LrCMO基因相对表达量逐渐下调至对照水平。     

小麦TaSPP基因的克隆及表达分析

为明确磷酸蔗糖磷酸酶基因(SPP)的表达特征和生物学功能,进一步了解SPP参与蔗糖生物合成的调控机制。以小麦抗旱品种晋麦47的cDNA为模板克隆出3个位于第5同源群上的TaSPP同源基因,分别命名为TaSPP-5A、TaSPP-5B和TaSPP-5D。并利用生物信息学对小麦TaSPP的理化性质、基因结构、顺式作用元件、系统进化树和蛋白保守结构域等进行分析,通过qRT-PCR分析基因TaSPP的表达模式。结果表明,TaSPP-5A、TaSPP-5B、TaSPP-5D都包含8个外显子和7个内含子,TaSPP-5A和TaSPP-5D编码422个氨基酸,TaSPP-5B编码413个氨基酸。系统进化分析显示,小麦TaSPP基因与小麦的近缘物种在进化上处于同一分支,相似度较高。qRT-PCR表达分析结果显示,TaSPP基因在根、茎秆、旗叶、叶鞘、颖花、种子中均表达,其中在旗叶和茎秆中表达量较高;ABA、PEG-6000、NaCl和IAA胁迫均能诱导TaSPP基因的表达,表明小麦TaSPP基因可能在逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

柠檬F-box基因的克隆及表达分析

本研究以香水柠檬幼嫩叶片为材料,在前期通过De Novo技术获得的F-box基因片段基础上设计引物,利用RT-PCR技术成功克隆出长度为585 bp的F-box基因,命名为LFB1,该基因编码194个氨基酸,该氨基酸序列在N端具有F-box结构域,生物信息学分析表明:该蛋白分子量为48.94 k D,等电点:5.2。进化分析发现其与克里曼丁桔(Citrus clementina)聚在一起。q RT-PCR分析表明:该基因在植株的根、茎、嫩叶、老叶、花蕾、花苞、幼果、成熟果中均有表达,LFB1基因在组织中的表达量是:茎老叶根花蕾成熟果嫩叶幼果;在花的不同器官的表达分析,发现该基因在雄蕊中的表达量最高,其它组织则相对较低,在雄蕊中基因的表达量是其它组织的10倍左右;在逆境胁迫下,该基因的表达量发生明显变化,表明该基因与植株的生长发育、花粉的发育以及环境胁迫可能有着一定的关系。     

苹果MdPDS基因的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是苹果类胡萝卜素生物合成途径的关键酶。本研究运用电子克隆与RACE技术克隆得到‘澳洲青苹’苹果Md PDS基因(Gen Bank登录号:KU508828),该c DNA序列全长2 005 bp,包含1 725个碱基(121~1 845 bp)的完整开放阅读框,编码575个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,Md PDS编码的氨基酸序列与其他植物的PDS蛋白具有很高的同源性;其同样含有一个二核苷酸结合域和一个类胡萝卜素结合域。系统进化树分析表明,Md PDS与杏、碧桃和草莓蛋白亲缘关系较近,聚为一类。实时荧光定量PCR结果表明,Md PDS在‘澳洲青苹’苹果不同组织均有表达,其在树皮、果皮及叶片中的表达要明显高于花中的表达。此外,Md PDS在着色期套袋果实果皮中的表达量随果色增加而上升,而在非套袋果皮中的表达则变化不明显。上述结果表明Md PDS在苹果果实色泽发育过程中起着重要作用,也为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

蒜芥茄染色体5 SrDNA、18 SrDNA和端粒序列位点检测及其核型分析

本研究以蒜芥茄为试验材料,取其根尖进行染色体制片,基于端粒保守重复序列、5 SrDNA和18 SrDNA为探针进行荧光原位杂交,观察探针在染色体上标记的位置和信号的强弱,应用染色体核型分析软件进行图像采集和染色体长度的测量分析。结果表明,蒜芥茄的核型公式为2 n=2 x=24=24 m(2 SAT),染色体上各有一对5 SrDNA、18 SrDNA位点,端粒序列(TTTAGGG)₆位于染色体的两端。蒜芥茄为二倍体,染色体臂比值在1.05～1.48之间,为中部着丝粒染色体(m),最长染色体与最短染色体之比为1.42,核型不对称系数为54.73%,属于较原始的1 A型。     

ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析

本研究通过SDS法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA,通过PCR的方法对ACS启动子2.5Kb的序列进行缺失改造,克隆到了长1 185bp的ACS启动子片段,与GenBank报道序列相比较同源性为93.2%.经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件,经预测ACS启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导.为验证其果实特异表达活性,通过插入到pBI 101.2中间表达载体上的GUS基因5＇端前,构建了含GUS基因的瞬时表达载体pBACS.用基因枪法将pBACS转化到香蕉果实中,结果表明：用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS组织化学染色后,都出现兰色斑点,对照没有出现兰色斑点.因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达.同时,通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA,然后根据报道的序列设计特异性引物,同时在上游引物中引入了Kozak序列,经PCR克隆到HBsAg基因序列,长度为681bp.NCBI BLAST分析的结果表明,获得的HBsAg基因序列及推导的氨基酸序列与GenBank中所报道的序列的同源率分别为97.2%和97.4%.将经过改造的HBsAg基因替代pBACS中的GUS基因,成功构建了含有ACS启动子和HBsAg基因的香蕉树果实表达载体,为下一步转化香蕉,获得在果实中表达HBsAg蛋白的转基因植株奠定了基础.     

桑树MaMYB308基因的克隆及表达分析

为研究桑树MYB转录因子在桑树非生物胁迫及发育中的功能,本研究以桑树品种'桂优62号'为材料,克隆了桑树MYB转录因子MaMYB308的全长cDNA序列,运用生物信息学手段对其氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交验证其自激活性,采用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式.研究结果显示,MaMYB...     

杜仲EuGT2基因的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)是植物次生代谢过程中一类重要的结构修饰酶,可参与催化受体分子进行糖基化修饰.本研究以杜仲为材料,基于前期构建的杜仲转录组数据设计杜仲糖基转移酶编码基因EuGT2克隆引物,克隆得到全长为285 bp的EuGT2片段,序列分析表明,该基因可编码...     

花生Rab2基因的克隆及表达分析

Rab2是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白从内质网到高尔基体的运输,研究发现有些Rab2基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得花生Rab2基因,本试验根据拼接的cDNA序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR克隆了1个花生Rab2基因。测序结果显示其cDNA含有长636 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含211个氨基酸,推测分子量为23.4 kDa。比对分析发现花生Rab2蛋白与多种生物的Rab2的氨基酸序列具有较高的同源性,荧光定量PCR研究表明AhRab2基因受低温、干旱、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控花生的抗逆性奠定了基础。     

越南油茶HMGCR基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中HMGCR (3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆得到HMGCR基因全长并命名为CvHMGCR,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvHMGCR全长1 800 bp,包括一个1 770 bp完整的开放阅读框,编码589个氨基酸,与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)、喜树(Camptotheca acuminata)、风铃辣椒(Capsicum baccatum)和三七(Panax notoginseng)的HMGCR蛋白序列相似度均在75%以上,系统发育树显示Cv HMGCR与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)和喜树(Camptotheca acuminata)的HMGCR蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为63.1kD,理论等电点为6.37,有两个跨膜螺旋区,属于不稳定疏水性蛋白。序列比对分析表明,CvHMGCR有4个...     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。