利用CRISPR/Cas9技术创建OsGPRP家族基因突变体

本研究利用CRISPR/Cas9技术对水稻OsGPRP家族基因进行敲除,在3个水稻OsGPRP基因的第一个外显子PAM序列区域各设计一个靶位点,并将3个靶位点的sg RNA进行串连,成功构建了3个OsGPRP基因同时敲除的CRISPR/Cas9载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得了60株T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序分析,我们获得了2种不同类型的OsGPRP3单基因突变材料;6种不同类型的OsGPRP2/OsGPRP3两基因突变植株;1种类型的OsGPRP1/OsGPRP3两基因纯合突变植株和4种不同类型的OsGPRP1/OsGPRP2/OsGPRP3三基因突变材料,为进一步研究OsGPRP家族基因的生物学功能及其相互关系提供遗传材料。     

利用CRISPR/CAS9基因编辑技术创制香型郑稻19新种质

有特殊香味的稻米深受我国消费者欢迎,是优质水稻的重要指标之一,本研究通过基因编辑创制香型优质水稻新种质。水稻中甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是控制香味的关键基因,以适于直播品种郑稻19为供体材料,利用CRISPR/CAS9技术定点突变水稻Badh2基因。获得T0代转基因阳性植株11株,其中9株子粒有香味,检测6个香型T1株系靶点序列,6个株系均发生突变,发现7种突变类型,5种是缺失类型,2种插入类型,其中3个株系（T1-2、T1-3和T1-7）出现双等位突变。6个T1代株系共测序22个单株,检测到纯合突变10株;T2代检测28株,其中纯合突变21株。以潮霉素抗性基因引物检测T1-2、T1-6和T1-7株系后代单株载体脱落情况,T1代3个株系未获得无载体纯合突变单株,T2代中获得8株无载体纯合突变单株,来源于T1-2株系有3株,来源于T1-7株系5株。T0代9株香型单株子粒2-AP含量1.259±0.072μg/g,T1代8个突变株系2-AP含量0.537±0.111μg/g,均显著高于对照郑稻19。考察中选T1-2、T1-7株系的农艺性状,与郑稻19无显著差异。这些无载体突变单株可作为香型种质在种质创新和育种中应用。     

水稻膜联蛋白基因OsAnn8干旱和低温条件下表达模式以及CRISPR/Cas9定点编辑

为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。     

应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系

SBE3是位于水稻第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因,该基因表达量的降低引起水稻抗性淀粉(resistant starch,RS)含量的提高。本研究应用CRISPR/Cas9系统对SBE3基因进行编辑,根据基因编码区序列(CDS)在第8外显子区域设计长度为20 bp的引导序列,化学合成引导序列并构建成sgRNA,将其插入到Cas9质粒骨架载体中,转化农杆菌。通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的p CAMBIA1300:SBE3sgRNA:Cas9表达载体转入水稻受体材料沪LPR18中。使用PCR扩增转基因阳性植株中含有CRISPR/Cas9靶点的片段并测序验证,确定12个突变单株,其中2个是纯合型,通过后代分离,得到没有潮霉素基因筛选标记的SBE3纯合突变单株,测定其抗性淀粉含量高达10%以上。以上结果表明,本研究已经通过CRIPR/Cas9技术获得稳定的高抗性淀粉水稻纯合突变体材料,为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源和创建方法。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

CRISPR/Cas9技术在获取拟南芥双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3与sb6的功能,需要创制这2个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥Col-0中的sb3、sb6基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer测序验证,共获得10株T0代转基因植株,其中5株在目标片段上没有发生编辑;另5株在sb3基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6基因的目标序列上只有2株发生了编辑。至此成功获得了sb3与sb6基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础。     

CRISPR/Cas9技术在获取双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3 与sb6 的功能,需要创制这2 个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对拟南芥Col-0 中的sb3、sb6 基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer 测序验证,共获得10 株T0代转基因植株,其中5 株在目标片段上没有发生编辑;另5 株在sb3 基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6 基因的目标序列上只有2 株发生了编辑。至此成功获得了sb3 与sb6 基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础     

CRISPR/Cas 9基因编辑技术降低贵州禾株高研究

为获得株高降低的贵州禾水稻新种质,以贵州禾高秆糯稻材料黎平杂边禾为研究材料,根据CRISPR/Cas 9靶位点设计原则设计水稻OsGA20ox2基因的特异性靶点sgRNA序列,构建水稻OsGA20ox2基因的CRISPR/Cas 9定点突变载体,利用农杆菌介导的愈伤转化法遗传转化黎平杂边禾,通过潮霉素筛选,以及PCR分子检测,获得16株转基因植株。对筛选获得的转基因植株基因进行测序,获得7株OsGA20ox2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。研究表明,T_1代突变体植株株高比黎平杂边禾降低了29.6%。     

烟草BBLc基因CRISPR/Cas 9载体构建与遗传转化

小檗碱桥状酶在烟碱生物合成的最后一步起到关键催化作用。本研究对小檗碱桥状酶基因家族中的BBLc基因进行研究,利用CRISPR/Cas 9技术构建BBLc基因的编辑载体,通过农杆菌介导法遗传转化烟草,经卡那霉素抗性筛选获得35株抗性苗,利用PCR和RT-qPCR技术鉴定获得7株突变株。观察发现,突变株烟叶褶皱程度较野生型增大,其余农艺性状与野生型相比差别不大。利用HPLC法测定盛花期叶片烟碱含量,突变株烟碱含量较对照平均降低了24.2%;其中突变烟株CB 10的烟碱含量为0.88%,降幅最大(37.6%)。研究表明,BBLc基因在烟草中表达量的降低引起烟碱含量的降低。     

利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术提高贵州禾产量研究

以贵州禾糯稻黎平杂边禾为研究材料,设计水稻产量控制关键基因OsCKX2的CRISPR/Cas 9编辑特异性靶点序列,构建水稻OsCKX2基因的CRISPR/Cas 9定点编辑载体,并利用农杆菌介导法导入黎平杂边禾,通过潮霉素筛选及PCR分子检测,获得20个独立的转基因植株。对筛选获得的转基因T_0代植株基因进行测序比对,获得7株OsCKX2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。对纯合的突变体T_1代植株农艺性状进行分析发现,与野生型黎平杂边禾相比,突变体的穗粒数增加16.67%,单株产量增加25.03%。本研究获得了产量增加的黎平杂边禾基因编辑的新种质。     

利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。     

CRISPR/Cas9技术编辑RMS2基因及其利用

水稻雄性不育是杂交水稻杂种优势利用的基础。为了推动粳型第三代杂交水稻育制种技术的发展,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通隐性核雄性不育基因RMS2进行定点编辑。根据CRISPR/Cas9基因编辑原理,以RMS2作为靶标基因,在基因第一和第二外显子分别选择正反向靶位点,在NCBI数据库利用BLAST工具分析靶位点特异性,最终构建一个双靶点的CRISPR/Cas9敲除载体。以粳稻品种‘中花11’作为受体,使用农杆菌遗传转化法转化受体获得21株T0代转化苗,通过对潮霉素抗性基因进行检测获得17株阳性苗。对17株阳性苗的2个靶位点分别进行测序分析,有13株在靶位点1发生编辑,突变频率为76.4%。全部植株都在靶位点2被成功编辑,突变频率为100%。不同靶位点发生的突变样式有较大差异。设计InDel标记用于重点株系10的分子标记辅助选择育种,最终获得无T-DNA成分的普通粳稻核不育系。本研究创制的新的rms2突变体和不含转基因成分的rms2粳稻不育系,不仅丰富了rms2的突变类型,也为进一步研究GDSL脂肪酶功能和粳型第三代杂交水稻创制了重要的材料。     

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。     

利用CRISPR/Cas9探究水稻OsPIN5c基因功能

生长素极性运输在植物生长发育中发挥着重要作用,生长素输出载体蛋白(PIN-FORMED,PIN)是控制生长素极性运输的关键蛋白。虽然部分水稻OsPIN基因功能已有报道,但水稻OsPIN5c的生物学功能仍有待研究。本研究在OsPIN5c第1外显子处设计靶点并构建CRISPR/Cas9载体,通过转化粳稻品种日本晴获得24株转基因植株, PCR产物直接测序分析表明其中15株发生突变,突变率为62.5%,突变类型为双等位突变;进一步从T1代突变体中筛选获得3种不同的纯合突变体,将其命名为ospin5c-1、ospin5c-2和ospin5c-3。序列比对分析表明,这3种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的398个氨基酸分别缩短为109、106和250个氨基酸;跨膜螺旋结构域分析表明, 3种突变体中OsPIN5c蛋白的跨膜结构完全消失;蛋白结构预测表明3种突变体中OsPIN5c蛋白螺旋结构明显减少。突变体的苗高、根长和不定根数均显著低于野生型植株。组织特异性表达表明OsPIN5c主要在根中表达。突变体根中OsPIN1a和OsPIN5b表达量提高;生长素合成关键基因OsYUC1、O...     

分子标记ST10对水稻条纹叶枯病抗性基因Stv-b~i的检测

近年来,利用与抗病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择已经成为抗病育种的重要手段。本研究利用显性标记ST10对24个水稻品种以及24个水稻品种中的镇稻88/武育粳3号和武运粳7号/徐稻3号的2个F2群体进行检测。PCR结果显示,17个抗病品种有8个能扩增出约727bp的目标片段;在镇稻88/武育粳3号杂交组合中,感病亲本武育粳3号和F2群体中的8个感病单株均不能扩增出目标片段,抗病亲本镇稻88、F1和13个不感病单株中的11株都能够扩增出目标片段;用于检测的武运粳7号/徐稻3号的F2群体中,8株感病单株没有检测出目标片段,而13株不感病的单株有9株扩增出目标片段。结果表明,ST10与条纹叶枯病抗性基因Stv-b^i紧密连锁,表现为共分离。     

利用CRISPR/Cas9敲除NbLFY基因延迟本氏烟开花时间

开花是植物从营养生长转向生殖生长的重要标志,过早开花会造成植物早衰,严重影响以营养体为产品器官的经济作物的产量和品质,因此研究植物开花基因并对其进行编辑以延迟开花时间具有重要的理论意义和应用价值。LFY基因可抑制叶原基生长并促进花分生组织及花器官形成,是调控植物开花的关键“分子开关”。为利用LFY基因延迟易早花植物的开花时间,本研究以本氏烟为试验材料,构建了NbLFY基因的CRISPR/Cas9敲除载体,利用农杆菌介导法转化叶盘并对编辑植株的表型进行了观察分析。结果表明,通过抗性筛选和PCR检测共获得了10株T₀代植株,靶位点测序分析发现其中有2株NbLFY基因发生了突变,编辑效率为20%,突变类型均为缺失了一个碱基(T)而造成了移码突变。对T₁代基因编辑植株进行表型性状观察发现,与野生型相比,基因编辑植株株高显著降低,现蕾期延迟20 d,第一花序节位也明显提高,表明NbLFY基因的突变导致本氏烟开花时间延后,生殖生长进程延迟。本研究结果证实了NbLFY基因可促进本氏烟开花,敲除该基因可以推迟开花时间。上述研究结果为其他经济作物利用LFY基因...     

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性

为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。     

棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定

【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。