中间锦鸡儿CiMYB60基因克隆及表达分析

本研究以中间锦鸡儿作为实验材料,利用PCR技术分别对CiMYB60基因的cDNA与gDNA进行了克隆。测序结果表明:CiMYB60基因的开放阅读框为1 035 bp,编码345个氨基酸,其基因组DNA序列长度为1 485 bp,含有2个内含子和3个外显子。生物信息学分析显示:CiMYB60所编码蛋白的N端包含2个MYB结构域,因此认为其属于典型的R2R3-MYB类蛋白。克隆得到CiMYB60基因的ATG上游序列1 848 bp,分析显示该启动子中包含一些与光反应、组织特异性表达、激素和非生物胁迫相关的响应元件。对CiMYB60基因的表达模式进行分析发现在脱水、NaCl和UV-B处理下其表达量随胁迫处理时间的延长而降低。上述研究结果表明CiMYB60基因可能参与中间锦鸡儿对非生物胁迫等逆境胁迫的响应过程,为进一步研究该基因在非生物胁迫中的功能和表达调控提供了一定的参考。     

小麦转录因子基因TaMYB70的分离和表达分析

为了探究小麦MYB转录因子基因TaMYB70的功能,采用同源克隆方法分离TaMYB70（MK024291）基因cDNA序列,运用生物信息学手段分析该基因序列特征,采用实时荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）检测其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,分离得到的TaMYB70部分序列长度为1 272bp,包含一个长度为1 008bp的开放阅读框,编码335个氨基酸残基。TaMYB70蛋白含有2个螺旋-转角-螺旋结构的Myb-type HTH DNA结合结构域。TaMYB70氨基酸序列与粗山羊草、二穗短柄草等植物MYB44同源性较高,与拟南芥R2R3-MYB转录因子第22亚族成员属于同一分支。qRT-PCR分析表明,TaMYB70在脱落酸胁迫下表达量升高,在PEG和NaCl胁迫下表达量下降,该转录因子可能参与小麦逆境胁迫应答。     

割手密2个DREB2基因的克隆与比较分析

干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein,DREB),在植物应对干旱、盐碱和低温胁迫的反应中起非常重要的调控作用。利用已知的甘蔗栽培种DREB2转录因子序列,设计引物,按照同源克隆的方法,获得了2个割手密DREB2基因组DNA序列,分别命名为Ss DREB2-a和Ss DREB2-f(Gen Bank登录号分别为:KU963272和KU963277)。序列分析结果表明,Ss DREB2-a基因序列全长为1 578 bp,Ss DREB2-f基因序列全长为1 729 bp,2个基因均包含1个内含子和2个外显子。Ss DREB2-a和Ss DREB2-f基因的c DNA序列全长分别为824 bp和971 bp,均编码262个氨基酸。序列比对分析显示,2个基因的序列相似性为96.6%,编码的蛋白相似性为98.9%,存在3个氨基酸变异位点。系统进化分析结果显示,割手密DREB2转录因子与高粱、牛鞭草、斑茅、玉米等植物的DREB2转录因子的同源关系最近。基因的获得为下一步了解DREB2基因表达与割手密抵御非生物胁迫能力之间的关系奠定了基础。     

雪菜BjSnRK2E基因的克隆及表达分析

环境胁迫是造成作物品质和产量损失的重要因子。Sn RK2家族基因编码植物体内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是影响植物抗逆境胁迫能力的关键调控基因。采用电子克隆与RT-PCR相结合的技术,从雪菜(Brassica juncea Coss.Var.Multiceps Tsen et Lee)克隆了一个Sn RK2基因,命名为Bj Sn RK2E(Gen Bank登录号为MF423121)。序列分析显示,该基因全长1 218 bp,编码区为1 089 bp,编码362个氨基酸。Scan Prosite预测显示,Bj Sn RK2E蛋白包含一个ATP结合位点和一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。多序列比对和进化树分析表明,Bj Sn RK2E蛋白与其他植物的Sn RK2蛋白分享较高的相似性,与拟南芥的At Sn RK2.6和马铃薯St Sn RK2.3蛋白亲缘关系最近,处在同一进化分枝。实时定量RT-PCR检测结果显示,Bj Sn RK2E基因在根部的表达量最高,其次是茎,叶片的表达量最低;Bj Sn RK2E基因积极参与高盐、干旱和ABA胁迫应答反应,推测该基因功能与植物抗逆境胁迫有关。     

观赏羽衣甘蓝BoMYB114基因编码区的克隆及序列分析

花青素是羽衣甘蓝叶片呈紫色、红色及粉色的重要色素,R2R3-MYB类蛋白被认为是调控植物花青素生物合成的转录因子。本研究以羽衣甘蓝叶片为试材,采用同源克隆的方法克隆BoMYB114转录因子基因的编码区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:BoMYB114基因编码区长度为753 bp,其包含1个完整的开放阅读框ORF,可编码250个氨基酸,预测蛋白的分子量为28.5 kD,等电点(pI)为9.08。BoMYB114蛋白不存在信号肽,很可能定位在细胞核中。BoMYB114蛋白含有2个MYB保守结构域,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角为主。进化树分析表明,羽衣甘蓝的BoMYB114蛋白与甘蓝型油菜MYB114蛋白序列的一致性最高。羽衣甘蓝BoMYB114基因的克隆与序列特征分析对于进一步研究该基因结构和功能及植物花青素合成代谢途径具有重要意义。     

白芨转录因子基因BsWRKY14的克隆与分子特性分析

WRKY转录因子在调节植物生长发育、抵抗生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用,分析WRKY家族成员的基因序列信息,为进一步研究基因功能提供前期研究基础。基于白芨转录组数据,对Bs WRKY14基因进行克隆;利用生物信息学方法对BsWRKY14蛋白的理化特征、保守结构域和亚细胞定位等特性进行分析,用DNAMAN和MEGA 6.0进行氨基酸多序列比对和进化关系分析。结果表明Bs WRKY14基因包含1个1 179 bp的开放阅读框,编码392个氨基酸,预测是定位在细胞核中的不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构域,BsWRKY14蛋白包含一个WRKY基因保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员;Bs WRKY14与铁皮石斛WRKY蛋白亲缘关系最近。白芨Bs WRKY14基因的克隆与分子特性分析为深入研究BsWRKY14基因在调节白芨生长发育和逆境胁迫响应中的作用提供数据支持。     

黑果枸杞LrDREB1基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

DREB(Dehydrate responsive element binding factor)转录因子是植物非生物逆境适应中的关键调节因子,该类转录因子具有保守的AP2/EREBP结构域,在低温、高盐等非生物逆境胁迫下,可调控下游逆境应答基因的表达,对增强植物的抗逆能力有重要作用。黑果枸杞具有极强的耐干旱、盐碱能力,为研究黑果枸杞DREB类基因在低温、盐碱响应中的功能,本研究以强抗盐灌木黑果枸杞总RNA为模板,基于前期转录组测序拼接序列,利用RT-PCR方法克隆得到一条DREB基因。该基因含有一个1116 bp的开放阅读框,编码372个氨基酸。系统进化树分析显示,Lr DREB1基因属于DREB亚家族A2组成员,与拟南芥AtDREB2B、AtDREB2E具有较高的相似性。荧光定量PCR结果显示,Lr DREB1受盐胁迫、ABA胁迫和低温胁迫诱导表达,可能参与依赖ABA的信号转导途径,调节黑果枸杞抗盐响应。本研究通过对黑果枸杞LrDREB1基因的克隆、序列分析和表达分析,为研究Lr DREB1的功能及黑果枸杞抗盐机理提供了帮助。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

白芨蔗糖转运蛋白基因BsSUT2的克隆和表达分析

蔗糖转运蛋白(SUTs)在介导蔗糖由源到库器官的长距离运输、植物生长发育以及抵抗逆境胁迫中发挥重要作用,研究白芨蔗糖转运蛋白BsSUT2的序列信息与表达模式,为揭示其蛋白结构及基因功能提供依据。基于白芨转录组数据,采用RT-PCR技术获得白芨Bs SUT2基因CDS全长,通过生物信息学软件分析Bs SUT2编码蛋白的分子特征,并对BsSUT2进行氨基酸序列比对与系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR技术检测BsSUT2基因的组织表达模式。结果表明,克隆获得的BsSUT2基因CDS全长为1 584 bp,编码527个氨基酸。BsSUT2蛋白包含12个跨膜结构域,亚细胞定位预测表明BsSUT2蛋白定位于质膜,与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰SUT2基因编码蛋白序列一致性高,隶属于SUT4亚族。Bs SUT2基因的表达具有组织特异性,其转录本在白芨幼苗的假鳞茎中表达量最高。推测BsSUT2基因在白芨生长发育和蔗糖的分配中发挥重要作用。本研究对白芨BsSUT2基因的序列特征与组织表达模式进行分析,为阐明Bs SUT2基因在蔗糖运输与分配、生长发育和逆境胁迫中的功能提供实验数据支持。     

醋栗番茄NHX4基因及其启动子序列的克隆与分析

本研究在醋栗番茄基因组鸟枪序列的基础上,基于同源序列的保守性,克隆了醋栗番茄液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白4基因(SpNHX4)的cDNA序列,对其响应盐胁迫的表达模式进行了分析。通过染色体步行法克隆了该基因的启动子区域,并通过生物学软件对该基因编码的蛋白和启动子序列进行分析。结果显示,SpNHX4的c DNA序列包含1 611 bp的开放阅读框,编码536个氨基酸。SpNHX4多肽链中疏水性氨基酸占多数,具有12个明显的跨膜结构区,符合跨膜蛋白的特征。荧光定量PCR结果显示,在NaCl胁迫条件下,SpNHX4在醋栗番茄根、茎和叶中的表达均上调,其中在叶中的表达量变化最为显著。通过PlantCARE软件对SpNHX4上游1 857 bp的启动子序列进行顺式元件预测,发现该启动子区域包含番茄典型的TATA-box"TTTTA"序列和CAAT-box转录增强子序列"CCAAT"。此外,还存在多个与激素、逆境、光诱导相关的元件。这些结果为进一步研究SpNHX4的功能和转录调控机制提供资料。     

东亚砂藓bZIP转录因子RjbZIP基因的克隆及表达分析

为研究b ZIP转录因子在苔藓植物中的生物学功能,以东亚砂藓转录组测序获得的一个与b ZIP转录因子同源性较高的基因片段为基础,采用RT-PCR技术克隆得到该基因的c DNA全长序列,命名为Rjb ZIP。该基因c DNA全长为1 477 bp,包含1个1 422 bp的开放阅读框,编码473个氨基酸,预测蛋白分子量为5.114 k Da,等电点为6.97。Rjb ZIP蛋白属于不稳定蛋白,无跨膜区和信号肽结构,亚细胞定位于细胞核。该蛋白含有典型的b ZIP结构域,该结构域包含一个亮氨酸拉链区,一个碱性结构域和一个谷氨酰胺丰富区。实时荧光定量PCR分析显示,在快速脱水、缓慢脱水和脱水后复水处理过程中,东亚砂藓Rjb ZIP基因均能被诱导表达,且对脱水后复水的反应更为迅速,推测该基因参与东亚砂藓抵抗逆境胁迫的应答,为后续进一步研究其功能特征奠定了基础。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

割手密DREB2类转录因子的克隆与比较分析

DREB类转录因子是一类植物中特有的,在非生物逆境胁迫中起重要作用的调控因子。本研究以割手密为材料,采用同源基因克隆的方法克隆获得2个DREB2类转录因子基因Ss DREB2-1和Ss DREB2-2(Gen Bank登录号分别为KU963264和KU963265)。序列分析表明,这2个基因的长度分别为814 bp和709 bp,分别编码262和227个氨基酸;预测其蛋白质分子量分别为28.66 k D和24.95 k D,等电点(PI)分别为5.42和6.47。氨基酸亲水/疏水性分析表明,这2个转录因子属于亲水性蛋白。多序列比对分析表明,两基因序列的相似性为98.7%。原核表达分析表明,这2个基因编码区能正常表达出目的蛋白,说明得到的这2个基因为功能基因而非假基因。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

番茄冷诱导基因SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究

从番茄中克隆了一个编码MYB转录因子家族R2R3-MYB亚类基因SlCMYB1。不同逆境胁迫下的表达模式分析结果表明,该基因受低温、高盐、干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明,SlCMYB1为核定位蛋白。为深入了解SlCMYB1基因与非生物逆境应答的关系,我们构建了SlCMYB1基因过表达载体来转化水稻,获得了16个转基因水稻株系。SlCMYB1在水稻中异源表达能显著提高转基因水稻植株的苗期抗冷性,增加脯氨酸合成的关键酶基因OsP5CS1,膜转运蛋白基因OsWCOR413等低温胁迫应答基因的表达水平,这暗示着SlCMYB1与OsP5CS1、OsWCOR413基因处于同一低温调控信号转导路径。本研究结果为通过遗传工程操控低温信号通路的方法改良冷敏感植物抗冷性提供了理论基础。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

绵果荠CBF基因启动子克隆及诱导特性分析

CBF基因不仅是植物CBF抗冷途径的枢纽,而且可以提高植物的抗冷能力。而植物的抗冷能力的提高是由于CBF基因调控下游抗冷基因的表达来实现的。本研究根据前期已克隆得到的绵果荠Ll CBF基因(JQ687132)序列,利用TAIL-PCR方法从新疆早春短命植物绵果荠基因组DNA中分离得到Ll CBF基因编码区上游1 172 bp启动子序列;将该序列连入克隆载体并测序,通过生物信息学分析表明,该序列含TATAbox、CAAT-box等典型的真核生物核心启动子元件,同时具有等逆境响应相关元件。在烟草叶片中的瞬时表达分析,进一步表明,在低温、干旱及盐胁迫诱导下该启动子序列具有驱动GUS报告基因表达的特性。本研究对新疆早春短命植物种质资源的开发利用及丰富作物逆境基因工程诱导启动子资源具有重要的实践意义。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

芝麻八氢番茄红素脱氢酶基因SiPDS的克隆与序列分析

来自芝麻的八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)的分离鉴定尚未见报道。本研究根据已报道植物PDS基因的氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码芝麻新蔡选抗PDS基因c DNA的中间片段。利用电子克隆技术,从芝麻EST数据库中比对得到一条高度同源的序列,并通过RT-PCR方法,从新蔡选抗成功克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因的c DNA,命名为Si PDS(Gen Bank登录号:KJ191121)。c DNA序列全长2 273 bp,开放阅读框长度为1 743 bp,编码580个氨基酸。根据克隆获得的全长c DNA序列设计引物,从新蔡选抗DNA中克隆获得Si PDS基因的全长DNA,长度为5 592 bp,转录区包括14个外显子和13个内含子。序列分析表明,Si PDS与其他植物的PDS蛋白序列高度相似;系统进化树分析表明,芝麻Si PDS与黄芩的亲缘关系最近。Si PDS基因可以用作植物病毒诱导的基因沉默载体的内源检测基因,在利用基因工程技术改良芝麻农艺性状方面具有较大的应用价值。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。