泸定百合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(LsS/TK)的克隆与表达分析

本研究根据从之前已构建的百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. lilii)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson) SSH文库中筛选到的一个S/TK EST序列,通过RACE结合RT-PCR技术克隆到1个泸定百合S/TK基因全长cDNA序列,该基因全长2 016 bp,开放阅读框长1 440 bp,编码479个氨基酸,命名为LsS/TK。保守域结构分析表明Ls S/TK具有典型的S/TK激酶保守亚结构域。进化树分析结果显示LsS/TK与拟南芥的APTK19的进化关系最近,而与其它植物的S/TK的进化关系都较远。实时定量PCR结果显示百合镰刀菌诱导后LsS/TK表现上调表达,推测该基因可能在一定程度上参与泸定百合抗镰刀菌病害途径。     

一个受黄萎病菌诱导的海岛棉功能基因GbVWR的克隆与表达

黄萎病是一种土传真菌维管束病害,严重影响棉花产量和品质。挖掘抗黄萎病相关基因对于棉花抗黄萎病遗传改良具有重要意义。本研究通过筛选黄萎病菌胁迫下的海岛棉全长cDNA文库和陆地棉SSH文库,获得一个与黄萎病菌胁迫相关的基因,命名为GbVWR。生物信息学特征和基因表达分析表明,GbVWR基因全长520 bp,开放读码框198 bp,编码65个氨基酸残基组成的蛋白,理论等电点为5.32,包含一个信号肽和一个跨膜区,是一种分泌蛋白。GbVWR基因可以诱导表达7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到真菌激发子响应、激素响应、伤口响应及黄酮生物合成基因调节等应答元件。GbVWR基因在海岛棉根中表达最高,茎中其次,叶中最低。受黄萎病菌诱导后,GbVWR基因在接菌后2 h可对黄萎病菌作出应答反应。此外SA、ET和GA均可显著诱导GbVWR基因的表达。初步推断GbVWR是海岛棉抵御黄萎病菌过程中一个新的功能基因,通过参与多种激素信号途径发挥功能     

陆地棉GhDAHP基因的克隆与表达分析

棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。     

百合花青素苷合成酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆百合花青素苷合成酶基因(anthocyanidin synthase, ANS),通过已报道的其他物种的ANS基因保守序列设计简并引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了百合ANS基因片段,该片段长701 bp,编码233个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,百合ANS基因编码的氨基酸序列与郁金香、荷兰鸢尾、甜樱桃的一致性分别为86%、81%、77%。采用半定量RT-PCR法分析表明,该基因在百合花瓣中的表达水平最高,叶和茎次之,鳞茎中不表达。本研究从百合中分离得到了ANS基因片段,为后续获得基因全长打下了基础。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

甘蔗脂氧合酶基因ScLOX1的克隆与表达分析

LOX属于脂氧合酶超家族(lipoxygenase superfamily),是脂肪氧化途径的重要因子,广泛参与植物生长发育的调节和对外界刺激的抵御。本研究基于甘蔗(Saccharumspp.)转录组数据库,通过RT-PCR技术,首次从新台糖22号(ROC22)蔗芽中克隆获得ScLOX1基因(GenBank登录号为MK106188)的cDNA全长序列。生物信息学分析显示,ScLOX1基因cDNA序列长度为2813 bp,开放读码框全长2664 bp,编码887个氨基酸,其编码蛋白的理论等电点为6.23,不稳定系数为39.77,亲水性平均值为-0.437,无信号肽和跨膜结构,但含有PLATLH2和Lipoxygenase活性位点,与高粱(Sorghum bicolor) LOX (XP002466613.1)的氨基酸序列相似性高达95.96%。预测ScLOX1基因的编码蛋白为酸性稳定亲水性非分泌蛋白,属于type I类非传统9-LOX。qPT-PCR分析结果显示,ScLOX1基因在蔗芽组织中特异性表达。接种甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)后, ScLOX1基因的表达量在抗病品种崖城05-179中短暂上升,但在感病品种ROC22中显著下降。分别对瞬时表达ScLOX1基因的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株叶片接种烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var. coeruleum)和青枯菌(Ralstonia solanacearum),表型观察、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)染色和烟草免疫相关基因的表达情况分析显示,ScLOX1基因的过表达能够增强本氏烟对烟草茄病镰刀菌蓝色变种的防御,但对烟草青枯菌的作用与对照相比无明显差异。研究还发现,ScLOX1基因的表达受茉莉酸甲酯和水杨酸抑制下调,但受脱落酸、氯化钠和聚乙二醇诱导上调。以上结果为深入研究甘蔗ScLOX1基因的功能提供参考资料。     

海岛棉DAHP基因的克隆及分子特性分析

棉花黄萎病严重影响中国的棉花产量和品质。本研究以海岛棉cDNA为模板扩增得到3个DAHP基因片段,分别命名为GbDAHP-1、GbDAHP-6、GbDAHP-7。序列分析显示,GbDAHP-1基因全长为1 755 bp,编码539个氨基酸,理论分子量为59.4 kD,等电点为8.70;GbDAHP-6基因全长为1 644 bp,编码519个氨基酸,理论分子量为57.176 11 kD,等电点为8.94;GbDAHP-7基因全长为1 554 bp,编码517个氨基酸,理论分子量约为57.177 14 kD,等电点为8.12。通过在线软件分析得知3个蛋白质的理化性质相似,均为亲水性蛋白,不含跨膜运输结构域,位于叶绿体。系统发育树显示：GbDAHP-1、GbDAHP-6和GbDAHP-7基因与陆地棉、雷蒙德氏棉、可可的序列相似度较高,与陆地棉以及雷蒙德氏棉的蛋白质相似度最高,亲缘关系最近。在黄萎病菌诱导下GbDAHP基因显示先上升后下降的趋势,表明该基因受到黄萎病菌诱导表达。     

木薯MeCREB基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和优化

本研究以木薯为材料,通过RT-PCR克隆出了MeCREB基因,核酸序列分析表明,所克隆的基因与phytozome数据库收录的MeCREB基因(Manes.04G058300.1)序列基本一致。MeCREB基因全长968 bp,其中开放性阅读框(ORF)为747 bp,编码248个氨基酸,预测得出MeCREB蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白,编码蛋白质的分子量为26.26 kD,理论等电点为5.99,GRAVY为-0.667。构建MeCREB-pGEX-6p-1表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,并对影响重组蛋白表达的4个主要因素(诱导温度,诱导起始菌量,IPTG浓度及诱导时间)进行优化,确定GST-MeCREB融合蛋白的最适表达条件。结果表明:重组工程菌生长至OD600=0.8时加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在28℃下诱导6 h,最适合GST-MeCREB融合蛋白的表达。本研究为高效诱导获得GST-MeCREB融合蛋白用于下游实验提供了最优方案,并为进一步研究MeCREB基因的生物学功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病病原菌海藻糖合成酶基因tps1

为了解tps1基因在尖镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析推测tps1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的海藻糖合成酶基因序列,参照尖孢镰刀菌番茄专化型的tps1基因序列设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了两个生理小种的tps1基因并测序进行比较分析,同时对香蕉与粉蕉苗诱导两个生理小种后的tps1基因表达量变化进行分析。结果表明,两个生理小种tps1基因全长均为1660 bp,开放阅读框均为1605 bp,编码535个氨基酸,基因序列间仅存在两个碱基位点的差异,编码蛋白间无差异;两生理小种的tps1基因序列与镰刀菌属其他种间存在较大的差异,经寄主诱导后的两个生理小种的tps1基因表达量呈现不同的变化。从tps1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,两个生理小种寄主选择性差异与tps1基因并无明显对应关系,这为进一步研究tps1基因与病菌在无寄主下的长期生存的关系奠定了基础。     

芝麻中一个富含脯氨酸新基因的克隆与特征分析

芝麻青枯病是影响我国南方芝麻产量及品质的重要病害。该病属细菌病害,由青枯雷尔氏菌引起。本研究利用随机引物对芝麻受青枯雷尔氏菌诱导前后进行基因差异表达分析,发现一个诱导明显下调的基因(片段)。将该片段克隆、测序后,在芝麻基因组数据库中比对其序列,得到一个ORF完整的全长基因。序列分析表明该基因无内含子,ORF长度为1458 bp,编码486氨基酸,其N端富含脯氨酸及富含脯氨酸的重复序列,属于富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP),将其命名为Si PRP(Sesamum indicum proline-rich protein)。根据该基因ORF两翼序列设计引物在芝麻c DNA中克隆到该基因,测序结果与预测序列一致。Blast分析表明该基因编码蛋白与其他植物中发现的PRP蛋白同源性很低,且其富含脯氨酸的重复序列在其他植物中也未发现,推测为一个新型富含脯氨酸蛋白。进一步设计基因专化的定量及半定量PCR引物进行其诱导表达分析,再次证明该基因受病菌诱导后下调表达。与其他植物中发现的大多数PRP蛋白定位于细胞壁不同,Si PRP主要定位于细胞膜,少量可以分泌到细胞外。烟草表皮细胞瞬时表达显示该蛋白定位在细胞膜上的特殊结构,推测该蛋白在芝麻和青枯雷尔氏菌的互作中发挥重要作用。     

百合LdGASA1基因克隆与生物信息学及表达分析

本研究从百合小鳞茎发育不同阶段蛋白质组数据中,筛选出调控鳞茎发育的上调表达基因LdGASA1,对其进行克隆、生物信息学分析及表达分析。序列分析显示LdGASA1基因全长725 bp,编码区CDS序列为336 bp,编码111个氨基酸。结构域分析显示,LdGASA1第52至第111个氨基酸含有一个典型的GASA保守结构域。其理化性质分析显示,编码蛋白质理论等电点(pI)为9.1,不稳定系数为35.14,属于稳定的疏水性蛋白,亚细胞定位预测该蛋白最可能定位在细胞质中,其二级结构主要为无规则卷曲(65.86%)和α-螺旋(22.52%),另外含有少量延伸链(12.60)和β-折叠(9.01%)。通过RT-qPCR分析发现LdGASA1基因在小鳞茎出现前表达量相对较低,主要在小鳞茎形态建成和发育阶段表达,且在小鳞茎形态基本建成(35 d)时表达量达到最高。本研究结果为探索GASA基因调控百合生长发育的机制打下基础。     

铁皮石斛DoSAMDC-like基因的克隆及原核表达

本研究从药用植物铁皮石斛中克隆得到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase)基因(DoSAMDC-like)并进行序列分析和原核表达。SAMDC基因家族具有多个成员,本研究采用同源克隆的方法对铁皮石斛中尚未报道的新成员DoSAMDC-like基因进行克隆,并与拟南芥SAMDC基因家族成员和铁皮石斛基因组注释序列进行比对分析、蛋白质特征及原核表达等分析。基因序列分析表明,DoSAMDC-like基因编码区全长1104 bp,推测编码368个氨基酸,氨基酸序列具有SAM_decarbox超家族共同的保守结构域。多序列比对及进化树结果表明,克隆获得的DoSAMDC-like基因序列对应于基因组测序注释的XM_020825443.2序列,一致性为99.55%,与铁皮石斛SAMDC1基因一致性为80.16%。异源表达结果表明,DoSAMDC-like基因受IPTG诱导,蛋白分子量约为47 kD。DoSAMDC-like基因的克隆和原核表达,可为参与铁皮石斛多胺代谢、生物碱合成相关基因的蛋白质生化活性等研究提供了帮助。     

TMV侵染烟草基因差异表达的cDNA-AFLP分析

以烤烟品种龙江925 [高抗烟草普通花叶病(TMV)]接种TMV的叶片为材料,选用240对引物组合的扩增, 获得约 9 500个转录基因片段, 经过克隆测序最终获得了12个诱导表达片段, 它们与核酸代谢、蛋白质合成与修饰、能量代谢、胁迫响应、细胞内运输、糖代谢等相关, 并利用荧光定量PCR分析一个诱导表达片段TIF2在0~72 h之间5个时间点(0、12、24、48和72 h)的基因差异表达, 证实了所获得的基因序列为真实诱导的表达序列。对此序列进行RACE, 最终获得全长cDNA序列, 全序列857 bp, 预测的编码区在101~613 bp之间, 共编码170个氨基酸。经Blastn、Blastp比对分析, 在烟草中没有获得其同源序列, 确定该基因是在烟草中发现的与抗TMV相关的新基因。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

海南粗榧GGPPs基因克隆与诱导表达分析

濒危植物海南粗榧富含多种抗癌活性次生代谢产物。为研究这些产物的生物代谢途径和表达调控,通过同源克隆和RACE技术获得了海南粗榧紫杉醇生物合成途径中通用前体牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(GGPPs)基因全长并进行了生物信息学分析。该基因命名为CmGGPPs(GenBank登录号:JX971119),并进一步利用不同激发子诱导研究了该基因对不同逆境信号的响应情况。结果表明:海南粗榧GGPPs基因cDNA全长1694bp,包含一个1182bp的ORF框,编码393个氨基酸;预测该基因编码蛋白质分子量为42.91kD,其等电位为7.12。通过BLAST比对结果分析,海南粗榧GGPPs基因全长核苷酸序列与红豆杉科植物的同源性最高可达91%,氨基酸序列有89%的相似性。同时,GGPPs基因氨基酸序列同其他植物也有较高的同源性。用不同类型激发子处理发现,GGPPs在诱导后表达量均上升,但不同激发子诱导的基因表达强度和速率存在明显区别。     

草莓叶黄素循环关键酶基因VDE和ZEP的克隆与分析

叶黄素循环在逆境胁迫中对植物光系统起着重要的保护作用。紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZEP)是调控叶黄素循环的关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE技术率先从草莓中克隆获得VDE和ZEP基因。VDE基因c DNA全长1 842 bp,ORF为1 467 bp,编码489个氨基酸;ZEP基因c DNA全长2 325 bp,ORF为1 980 bp,编码660个氨基酸。生物信息学分析表明草莓VDE与ZEP基因所编码的氨基酸序列与蔷薇科的苹果、桃和梅等植物的亲缘关系较近。荧光定量分析发现VDE和ZEP基因在草莓根、茎、叶、花、果实中皆有表达,说明二者均为组成型表达基因,并且叶片中基因的表达量最高而根中最低,推测与其在草莓叶黄素循环调控的作用有关。     

玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及表达分析

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases, SCP)基因在植物生长发育及抗病性方面起着重要作用。本研究在立枯丝核菌胁迫24 h后, 以RT-PCR技术和RACE技术克隆玉米丝氨酸羧肽酶基因全长cDNA序列, 命名为ZmSCP。结果显示, 该基因全长为1874 bp (GenBank登录号为JF682634), 开放阅读框为999 bp, 编码332个氨基酸, 相对分子量为36.505 kD, 等电点为4.75。ZmSCP基因编码蛋白与其他高等植物中该蛋白具有一定的同源性, 同源性比例范围为42%~81%。进化树分析表明ZmSCP基因与水稻、高粱亲缘关系较近, 属于同一进化分支。ZmSCP基因编码蛋白序列保守结构域分析显示该基因编码产物具有S10结构域, 属于S10超家族。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR结果表明, ZmSCP基因在立枯丝核菌、ABA、JA、低温、高盐胁迫条件下, 总体均呈诱导表达的趋势。其中, 在立枯丝核菌AG1-IA诱导下, ZmSCP基因表达呈两步诱导趋势, 第1次诱导出现在接菌后24 h, 然后下降, 第2次诱导出现在接菌后60 h。在ABA、JA、低温和盐胁迫下, ZmSCP基因表达均呈现上调趋势, 表达高峰均出现在胁迫后48 h。     

玉米ZmCIPK20基因克隆及表达分析

CIPK蛋白激酶是植物非生物胁迫信号传导途径中的重要元件。为克隆玉米CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20全长c DNA序列,并分析其在盐胁迫下的表达模式,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的序列进行分析,采用荧光定量PCR方法研究ZmCIPK20在盐胁迫下的表达。本研究从玉米中克隆了一个编码CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20,该基因c DNA全长1 800 bp,5'-非编码区长203 bp,3'-非编码区长202 bp,编码区长1 395 bp,编码464个氨基酸,预测分子量为50.993 kD,等电点为8.55。推测的氨基酸序列中含有1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和1个NAF结构域。进化树分析发现,ZmCIPK20和SbCIPK分为一个分支。荧光定量PCR检测表明,ZmCIPK20基因受盐胁迫诱导表达,在根中下调表达,在叶中上调表达,说明玉米ZmCIPK20基因可能参与玉米对盐胁迫的应答,为揭示该基因的生物学功能提供依据。     

津田芜菁泛素化相关蛋白基因BrRUB1的克隆及表达分析

RUB1(related to ubiquitin 1)是植物和酵母中一种泛素类似蛋白质,是Cullin家族的一个成员。为阐释津田芜菁Br RUB1基因的表达特性,本研究克隆了津田芜菁RUB1基因的全长c DNA序列,命名为Br RUB1,Gen Bank登录号为KF501173。其ORF全长471 bp,编码156个氨基酸;亚细胞定位结果显示,Br RUB1-GFP定位于细胞核,表明Br RUB1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。q RT-PCR检测Br RUB1的表达表明,该基因表达量在花蕾中最高,花瓣中次之,具有组织特异性。而且Br RUB1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.