植物叶绿体遗传转化及研究进展

叶绿体遗传转化与传统的细胞核遗传转化相比具有许多独特的优点：外源基因表达效率高,可同时转化及表达多个基因,由于通过母性遗传,因此没有基因沉默现象及位置效应,也不会造成外源DNA的扩散。目前已经有超过四十多个外源基因整合到烟草等作物的叶绿体基因组中,表现出理想的农艺性状或作为生物反应器表达高水平的生物疫苗。本文对植物叶绿体基因组转化技术的原理和优点,外源基因导入叶绿体基因组的方法,以及目前叶绿体转化研究的最新进展进行了综述,并对其应用进行了展望。     

Bt基因转化玉米培育抗玉米螟自交系

采用基因枪法将苏云金杆菌(简称Bt)的杀虫毒蛋白基因(CryIA)导入东北春玉米自交系铁7922的幼胚中,诱导愈伤组织.抗虫基因的表达载体是pBI121,包含Bt杀虫毒蛋白基因和新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因,筛选标记bar由CaMV 35S启动子驱动.通过对后代植株的除草剂草丁膦(PPT)筛选、分子鉴定和ELISA法检测,证明外源基因已经整合到玉米基因组中并可以稳定遗传.对转基因株系进行田间接玉米螟虫卵,调查不同生长时期的危害指数,最终筛选出一批抗玉米螟自交系.     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

除草剂抗性基因bar导人烟草叶绿体

将编码Phosphinothricin acetyltrans ferase的bar基因与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建成表达盒,连同烟草叶绿体基因组同源片段rpl2-trnH-psbA和trnK-ORF509A以及选择标记基因aadA一起构建成烟草叶绿体转化载体pTZBA。基因枪法转化烟草叶片,经壮观霉素筛选获得转化再生植株。分别以1.0 kb的叶绿体同源片段trnK-OR     

叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性

根据已构建的大豆叶绿体表达载体pJY01,设计特异性引物,将昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149插入此载体中构成叶绿体表达载体pJY01-MpAFP149,利用基因枪轰击法转化烟草,经壮观霉素筛选获得4株叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草株系。PCR和PCR-Southern结果显示外源基因已整合至烟草叶绿体基因组中但同质化水平不高,RT-PCR结果也表明昆虫抗冻蛋白基因已发生了转录。将野生型烟草、叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草及核转化T₁代转抗冻蛋白基因烟草(pCAMBIA1302- MpAFP149)于–1℃低温处理3 d,观察耐寒表型及测定相对电导率。结果表明, 叶绿体型转基因烟草的耐寒表型优于野生型烟草,但与核转化的T₁代转抗冻蛋白基因烟草无显著差异。处理3 d时,叶绿体型转基因烟草和T₁代转抗冻蛋白基因烟草的电导率分别为39.2%和38.2%,而野生型烟草已达73.7%。本实验获得的异质化转叶绿体抗冻蛋白基因烟草与转核基因烟草的耐寒力无差异。     

菊苣叶绿体同源片段的克隆及多顺反子定点整合表达载体的构建

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnV-16S rDNA基因在内的一段序列(GenBank登录号为GQ199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aadA及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aadA-gfp-psbA-3,′然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pJAG,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。     

烟草叶绿体转化载体的构建及转基因植株的获得

选择烟草叶绿体基因组同源片段ｒｐ１２－ｔｒｎＨ－ｐｓｈｂＡ和ｔｒｎＫ－ＯＲＦ５０９Ａ,及ａａｄＡ抗壮观霉素基因,构建烟草叶绿体转化载体ｐＴＲＺ,制备ｐＴＲＺＤＮＡ金粉子弹,通过基因枪轰击烟草幼苗叶片,经壮观霉素筛选获得了愈伤组织和转化再生植株,对烟草叶绿体转化植株进行ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,结果证明其中Ｎｏ１３,１６,２３为整入了外源ａａｄＡ的叶绿体转基植株,同时其子代呈现壮观霉素抗性ａａＤ     

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础.     

水稻巯基蛋白酶抑制剂基因在烟草叶绿体中的表达

将水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) cDNA基因克隆、测序分析后,与烟草(Nicotiana tabacum L.)叶绿体16S rDNA基因启动子和T393终止子构建表达盒,与抗壮观霉素选择标记基因aadA表达盒相连,以烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和ORF512一起构建成叶绿体转化载体pZOC.通过基因枪轰击烟草幼苗叶片,壮观霉素筛选,获得转化再生     

重组人表皮生长因子基因遗传转化烟草研究

将携带内质网滞留信号肽SEKDEL编码序列的重组人表皮生长因子基因（hEGF）克隆到植物表达载体中构建植物表达载体pSH-hEGFS,通过冻融法将pSH-hEGFS转化到根癌农杆菌LBA4404中,以烟草无菌苗叶盘为外植体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,经抗生素抗性筛选获得抗性植株,通过GUS组织化学染色分析、PCR检测以及RT-PCR分析,证明重组人表皮生长因子基因已整合到烟草基因组中并已表达,间接法ELISA检测结果表明转基因烟草中重组人表皮生长因子表达量最高达叶片总可溶蛋白的0.003%。     

烟草叶绿体16S启动子的克隆改造及转基因植株的获得

设计引物并克隆了烟草叶绿体16SrDNA基因的启动子,并在其下游加入了rbcL基因的SD序列,以使该启动子能有效翻译外源基因;进一步以aadA基因作为外源基因,以psbA基因的3’序列为终止子,构建成aadA基因表达盒;将此表达盒插入烟草叶绿体同源片段trnK-psbA-trnH中,构建成烟草叶绿体转化及表达载体p16T。用基因枪微弹轰击转化     

3个抗虫耐盐基因载体对烟草的遗传转化及表达分析

病虫害和土壤盐渍化是影响烟草生长发育的重要因素,转基因技术已成为改善这一现状的有效手段。本研究将部分改造的Bt基因Cry1Ac基因、Cry3A基因及NTHK1基因构建在同一载体上,利用农杆菌介导法转化野生烟草植株。经PCR检测,获得10个转基因株系。经荧光定量PCR检测,Cry1Ac基因表达量在104~10~5数量级,1号转录丰度1.58×10~5为最高,而Cry3A基因表达量在10~5~10~6数量级,10号转录丰度1.34×10~6为最高;10个转基因株系双Bt基因均得到表达且存在表达差异,而对照烟草没有Bt基因表达。经ELISA检测,转基因烟草Cry1Ac蛋白平均表达量为150.441 ng/g,变化在0.86~201.74 ng/g;Cry3A蛋白平均表达量为1 192.592 ng/g,变化在23.33~2413.47 ng/g。经过对烟草斜纹夜蛾的虫试,初步证明转基因植株获得了抗虫性。组培苗耐盐试验表明,不同盐浓度条件下,转基因株系的分化状况优于对照。证明抗虫耐盐多基因的一次性转化,可提高烟草的抗虫能力和耐盐性。     

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。     

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。     

转Bt cry1Ah/2mG2-epsps双价基因抗虫/耐除草剂玉米研究

构建了含有Bt杀虫基因cry1Ah和耐草甘膦基因2mG2-epsps的双价植物表达载体pMAGUHM,通过基因枪轰击Q31×Z31杂交组合的胚性愈伤组织,以2mG2-epsps为筛选标记,通过1mmol/L草甘膦异丙胺盐筛选,获得T0代转化植株80株,其中PCR检测有36株为阳性植株,阳性率达45%。对得到的阳性植株的T1、T2代进行了跟踪检测,证明外源基因已整合到玉米基因组中并正确表达。草甘膦及玉米螟抗性检测结果表明,有5个转基因品系表现出具有耐草甘膦和抗虫的双重特性。     

马铃薯多基因质体转化载体及其在光呼吸支路构建中的应用

为了将大肠杆菌的乙醇酸代谢途径引入马铃薯叶绿体构建光呼吸代谢支路,同时规避目标蛋白不能通过叶绿体信号肽定位的风险,研究采用了Cre-Lox P多基因组装、融合蛋白表达、多顺反子表达等技术构建多基因质体转化载体,一次性将目标基因引入叶绿体基因组。研究成功构建了多基因质体转化载体,将编码壮观霉素抗性筛选标记氨基葡糖苷腺苷转移酶aad A、绿色荧光蛋白GFP、大肠杆菌乙醇酸脱氢酶(EcGLC)的3个亚基,乙醛酸聚醛酶(EcGCL)和羟基丙二酸半醛还原酶(Ec TSR)的7个基因添加到受体载体,最终的载体大小为18.1 kb。在构建的过程中,研究发现供体受体质粒的大小比例、Prrn启动子在细菌中的启动基因的表达等问题严重影响重组的效率。以上研究结果为光呼吸的代谢改造研究提供了一个新的思路,并解除了质体转化载体构建中基因数量的限制,对于叶绿体中复杂的代谢途径构建具有借鉴意义。     

棉花arf1启动子驱动Cry1A基因在烟草中特异性表达研究

在新一代Bt作物以及Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究构建了植物表达载体pGBI121.A1Bt, 其携带棉花arf1启动子驱动Cry1A基因的表达盒, 启动子后面有一个Ω序列; 对照载体pGBI121.4AB携带P2E35S启动子(增强子加倍的修饰CaMV 35S启动子)驱动Cry1A基因的表达盒, 在启动子后面也有一个Ω序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体pGBI121.4AB和pGBI121.A1Bt转化烟草, 分别获得44株和42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶中Cry1A基因的平均表达水平分别为pGBI121.4AB的1.5、1.5、1.4和0.3倍。棉花arf1启动子在烟草中表达, 证明了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达Bt毒蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。     

陆地棉GhSAD2基因表达载体的构建、转化及抗寒性初步分析

为研究Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因的功能及其与植物抗寒性的相关性,以陆地棉GhSAD2基因(KX197920)为目的基因,构建植物表达载体pBI121-GhSAD2,将该表达载体通过电击法导入根癌农杆菌GV3101中,采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草。通过PCR和GUS活性染色鉴定外源GhSAD2基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。将转pBI121-GhSAD2型和野生型烟草置于4℃下处理48 h后,检测其电解质渗漏率并观察其表型。研究结果证明目的基因GhSAD2已整合到烟草及棉花的基因组中,共获得转基因植株9株,转化率为75%。陆地棉GhSAD2基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,从而提高植物细胞的低温防御能力,为进一步探究该基因的功能鉴定了基础。     

构建结球甘蓝KIN基因在叶绿体基因组定点表达的载体

获得叶绿体基因组定点整合表达载体是开展结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化研究的第一步。本研究克隆了CMS结球甘蓝的抗冻蛋白KIN基因,发现该基因定位于结球甘蓝的2号染色体上。通过构建中间载体p KA和p AI,将KIN基因的编码区构建到了CMS结球甘蓝叶绿体基因组定点整合表达载体p IKAA中。该载体以Trn A和Trn I基因片段作为同源整合片段,能整合到CMS结球甘蓝叶绿体基因组中。此外,该载体是双顺反子形式的,即在转录的单条m RNA上,同时包含了KIN和aad A基因编码区。将p IKAA转化到大肠杆菌中,结果显示转化有该载体的大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素(AMP)和壮观霉素(SPEC)的固体LB平板中生长。研究结果可为后期CMS结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化体系的建立奠定基础。     

转Bt基因‘南林895’杨对美国白蛾和杨小舟蛾抗虫性分析

本研究以转Bt基因‘南林895’杨12个株系扦插苗为试验材料,分析其对美国白蛾和杨小舟蛾的虫害抗性。利用PCR、ELISA等技术对转抗虫基因杨树进行分子检测,同时在室内控制条件下对美国白蛾和杨小舟蛾进行抗虫性分析。PCR分析结果显示在12个转基因株系中均检测到了Bt目的基因片段。ELISA分析结果显示Bt毒蛋白浓度范围为371.9～10 698.2 ng/g,且不同株系间存在一定差异。转Bt基因杨树饲虫分析结果表明,12个转基因株系对美国白蛾和杨小舟蛾均有一定的杀虫活性,其中转基因株系A-4-6、A-5-0、A-3-4、A-5-23、Z-1-3的抗虫性较显著。株系A-5-0对杨小舟蛾1龄幼虫12 d校正死亡率达87.2%,对美国白蛾的18 d校正死亡率为65.6%。且转Bt基因‘南林895’杨对美国白蛾和杨小舟蛾幼虫的取食和生长有明显的抑制作用。在对12个转Bt基因株系的分子检测和饲虫试验中,Bt毒蛋白的表达水平存在差异且抗虫效果与Bt毒蛋白浓度的高低有关。