中间锦鸡儿CiMYB185基因克隆及表达分析

为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理,本研究以中间锦鸡儿为试验材料,从实验室已建立的转录组数据库中选取转录因子CiMYB185编码基因作为研究对象。利用PCR技术分别以cDNA与g DNA为模板对CiMYB185基因进行全长克隆。测序结果表明:CiMYB185基因的开放阅读框为909 bp,编码303个氨基酸,其基因组DNA序列长度为1 592 bp,含有1个内含子和2个外显子。序列分析发现该基因所编码蛋白的N端包含2个MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB类蛋白;利用染色体步移技术克隆得到908 bp的ATG上游启动子序列,序列中包含一些与光反应和激素相关的元件。该研究为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理奠定了基础。     

中间锦鸡儿CiATAF1基因的亚细胞定位及表达分析

为研究NAC转录因子在非生物胁迫条件下的表达,以中间锦鸡儿为材料,克隆并分析了NAC转录因子家族CiATAF1基因。该基因ORF全长为873 bp,编码291个氨基酸,由2个内含子和3个外显子构成,具有典型NAC结构域。染色体步移法获得CiATAF1基因启动子826 bp,该启动子含有光、激素、厌氧诱导等多种响应元件。经拟南芥叶片原生质体瞬时表达分析亚细胞定位,CiATAF1基因主要定位于细胞核中。荧光定量分析表明:CiATAF1基因表达具有组织特异性,相比于中间锦鸡儿根和茎,在叶部表达量最高;在干旱、盐、冷、ABA处理下,CiATAF1基因表达量增加,推测该基因可能与非生物胁迫应答相关。CiATAF1同模式植物拟南芥及豆科其他植物的同源基因做多重序列分析,序列一致性为81.14%,表明ATAF1基因序列结构相对保守。生物信息学分析CiATAF1蛋白质属于不稳定的亲水蛋白,二级结构主要由α-螺旋、β折叠、无规则卷曲构成。研究结果对挖掘中间锦鸡儿抗非生物胁迫的基因和深入分析逆境胁迫机理具有重要意义。     

烟草ERF基因NtRAP2-7的表达载体构建及表达模式分析

为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。     

澳洲坚果MiMYB3基因克隆及结构与功能分析

为研究R2R3-MYB转录因子家族成员在澳洲坚果生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等的调控机制,利用PCR技术从澳洲坚果品种‘桂热1号’叶片中克隆MiMYB3基因。采用生物信息学和荧光定量PCR(RT-qPCR)对其结构及功能进行分析预测。本研究克隆获得MiMYB3基因cDNA序列全长1 110 bp (NCBI登录号:MN254977.1),开放阅读框(ORF)长度为951 bp,共编码316个氨基酸。MiMYB3属于R2R3-MYB家族,其不存在跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水蛋白。系统进化分析将MiMYB3与AtMYB94、AtMYB96、AtMYB30、At MYB31和AtMYB60聚类为S1亚族。RT-qPCR分析发现MiMYB3基因主要受水杨酸处理诱导显著上调表达,表明MiMYB3响应水杨酸处理。推测MiMYB3调控澳洲坚果水杨酸生物合成途径相关基因的表达进而参与植物抗病过程,为深入研究其结构和功能打下基础。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

扁桃AcCBF2基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

本研究根据扁桃生物信息学数据库,采用PCR的方法从扁桃(Amygdalus communis L.)中克隆了一个CBF转录因子基因,命名AcCBF2,基因开放阅读框(open reading frame,ORF)为717 bp,编码238个氨基酸,预测其分子量26.59 kD,等电点为5.29。氨基酸多重序列比对显示,AcCBF2基因编码的氨基酸与其它植物冷胁迫相关的CBF氨基酸序列具有高度同源性,含有一个AP2功能结构域和2个特征基序;系统发育树分析显示,AcCBF2基因属于DREB家族中的A-1亚族,荧光定量显示,AcCBF2基因只对低温和干旱胁迫有响应,对盐胁迫和ABA(脱落酸)没有明显响应。在低温胁迫下,表达量上调;而在干旱胁迫下,表达量先上调后下调。初步预测AcCBF2基因可能对扁桃非生物胁迫有重要的调控作用。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。     

桑树MaMYB308基因的克隆及表达分析

为研究桑树MYB转录因子在桑树非生物胁迫及发育中的功能,本研究以桑树品种‘桂优62号’为材料,克隆了桑树MYB转录因子MaMYB308的全长cDNA序列,运用生物信息学手段对其氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交验证其自激活性,采用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式。研究结果显示,MaMYB308基因全长1 266 bp,包含一个1 026 bp的开放阅读框,可编码341个氨基酸,其编码蛋白质分子量为39 kD;具有两个SANT结构域,属于典型的R2R3型MYB转录因子,具有自激活活性。BLAST结果显示,MaMYB308与来源高等植物的多种R2R3-MYB类转录因子均具有较高的同源性,与川桑的MYB308同源性最高,氨基酸水平的一致性为96.48%。实时荧光定量PCR分析结果显示,MaMYB308在桑树根、茎和叶片组织中均有表达,在根中的表达量显著高于茎与叶片的表达量,且对高温、低温、高盐和干旱等非生物胁迫均有响应,其中对低温胁迫诱导最为显著,表达量为对照的40倍左右。本研究结果为进一步研究桑树MaMYB308基因的生物学功能及桑树的抗逆机理提供了帮助。     

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C_(1417)H_(2246)N_(394)O_(423)S_5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。     

大豆GmGLDH基因的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究大豆L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因Gm GLDH-Glyma.02G166300 (以下简称GmGLDH)的功能,本研究采用同源克隆法获得大豆GmGLDH基因,开展了相关生物信息学分析,并对其非生物胁迫下表达模式进行调查。结果表明,GmGLDH基因包含一个长度为1 752 bp的ORF序列,编码584个氨基酸。GmGLDH蛋白为亲水性较强的蛋白;二级结构中以无规则卷曲和α螺旋结构为主;预测亚细胞定位GmGLDH主要分布在线粒体中,分析结果并未发现跨膜结构域和信号肽结构;该蛋白序列中存在磷酸化位点56个。进化分析表明,克隆的GmGLDH氨基酸序列与菜豆、苜蓿的同源关系较近。基因上游顺式调控元件分析表明该基因可能参与光应答、激素响应、高温响应等,但光处理下大豆子叶中Gm GLDH基因的表达变化不大,且和子叶中抗坏血酸含量无相关性;4种非生物胁迫处理下大豆叶片中Gm GLDH基因是先下调后上调表达,和抗坏血酸含量变化呈反相关。本研究为进一步研究GmGLDH基因在大豆抗逆中的作用提供了重要的帮助。     

柠条锦鸡儿CkF5H基因及启动子的克隆

为了研究CkF5H基因在柠条锦鸡儿中木质素生物合成途径方面中的生物学功能,以我国西北干旱荒漠地区重要的豆科饲用灌木柠条锦鸡儿为材料,克隆了1个木质素合成相关的CkF5H基因,该基因c DNA全长1 679 bp,g DNA全长3 495 bp,具有2个外显子,1个内含子,编码520个氨基酸,Gen Bank登录号HQ829862。通过染色体步移的技术克隆了1 550 bp的启动子序列,对启动子序列上的响应元件进行了分析。结果显示,具有昼夜节律响应元件、防御与胁迫响应元件、赤霉素顺式作用元件和热响应元件等。CkF5H富含二级结构,其中α螺旋占39.81%,β折叠占15.96%,不规则卷曲占44.23%,并预测其三维结构。对CkF5H基因推导的氨基酸序列预测分析得出,CkF5H蛋白等电点为6.45,分子量为58.09 ku,不稳定系数45.72,是不稳定蛋白,总平均亲水性-0.143,属亲水性蛋白。因此,克隆柠条锦鸡儿的CkF5H基因并详细分析,可为进一步研究该基因提供理论依据。     

黄瓜CsRAX2的克隆与表达分析及原核表达蛋白诱导

作为最大的转录因子家族,MYB转录因子广泛参与植物的生长发育以及对胁迫的响应与耐受。CsRAX2是黄瓜MYB转录因子家族成员之一,本研究通过同源克隆法克隆了CsRAX2全长,分析了该转录因子基因的生物信息和表达特征,在原核表达系统中诱导并纯化该蛋白。结果表明,CsRAX2全长939 bp,编码321个氨基酸,定位在3号染色体。CsRAX2蛋白定位在细胞核,与其他物种MYB的进化关系很近,是一个典型的R2R3-MYB转录因子。CsRAX2表达具有组织特异性,且低温处理显著诱导采后黄瓜CsRAX2表达,表明其可能在采后黄瓜低温反应调控中发挥作用。启动子元件分析显示,该基因启动子中含有多个环境和激素响应元件,表明非生物胁迫可能通过激素信号调控CsRAX2表达。原核表达研究表明,培养温度影响原核表达蛋白的诱导效果,降低细菌培养温度能提高上清液中融合表达蛋白产量。本研究结果为进一步研究黄瓜CsRAX2基因的生物学功能及黄瓜耐冷性机理提供了帮助。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

中间锦鸡儿CiCML23基因克隆及序列分析

本研究以抗旱、抗寒、耐盐碱的中间锦鸡儿为材料,筛选其优良抗逆基因,为林草基因工程提供基因源。在中间锦鸡儿干旱胁迫转录组文库中找到1条注释为CiCML基因的序列,设计引物对其进行克隆。克隆得到CiCML基因cDNA序长列817 bp,包括426 bp开放阅读框,编码142个氨基酸。通过比对分析发现该基因与豆科模式植物蒺藜苜蓿CML23基因同源,具有较近的亲缘关系,因此命名为CiCML23。预测其等电点为4.42,分子质量为15.65 kD,是稳定的亲水性蛋白,存在CML典型的EF-hand结构域。初步阐明CiCML23基因的序列特征,为进一步预测CiCML23基因的功能提供参考依据。     

棉花GhCYSTM9基因的克隆及在非生物胁迫下的表达分析

CYSTM是真核生物中广泛存在的一类小分子蛋白,其在细胞信号转导、逆境防御反应中发挥着非常重要的作用。为了研究CYSTM基因在棉花非生物胁迫响应中的功能,本研究利用RT-PCR方法从陆地棉中克隆了GhCYSTM9基因。该基因c DNA全长237 bp,编码78个氨基酸,所编码蛋白具有一个C端保守的富含半胱氨酸的TM螺旋和特异的N端胞质元件。多重比对发现,GhCYSTM9与拟南芥CYSTMs具有较高的相似度,其中与AtCYSTM9 (NP566703.4, AT3G22240.1)序列一致性最高,达68.33%。荧光定量PCR分析其组织表达特性发现,GhCYSTM9基因在雄蕊、花瓣、根和花萼中显著高表达,在叶片、茎和雌蕊中表达量较低。进一步研究发现,GhCYSTM9基因的表达受到低温、干旱和盐胁迫的诱导,在胁迫处理下,其表达水平均呈现显著的上调表达。非生物胁迫下的基因表达分析结果显示,该基因在棉花非生物胁迫响应中有重要作用。本研究为进一步开展GhCYSTM9基因功能研究奠定了理论基础。     

枣ZjERF53转录因子的转录激活分析及互作蛋白筛选

乙烯应答因子广泛参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应过程。本研究克隆了1个在枣(Ziziphus jujuba Mill.)果实成熟后期高表达的ZjERF53转录因子,对其进行了亚细胞定位、转录激活活性和互作蛋白筛选研究,以揭示其生物学功能。研究结果表明：ZjERF53基因编码区序列全长为1 155 bp,能在细胞核和细胞膜中表达;ZjERF53具有自激活活性,其转录激活功能区域位于蛋白序列C端;以无自激活活性pGBKT7-ZjERF53-N为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选枣果实cDNA文库,共获得4个互作蛋白。本研究揭示了ZjERF53可能参与枣树抗病和抗旱等非生物胁迫响应,为解析ERF参与调控枣树生物学过程的分子机制提供了工作基础。     

辣椒3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CaGAPB的克隆及表达分析

本实验采用RT-PCR和RACE的方法,我们从辣椒叶片中克隆到3-磷酸甘油醛脱氢酶β亚基基因(CaGAPB)的全长序列,基因编码区共1 359 bp,编码452个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为48.2 kD,等电点6.52;进化树分析表明CaGAPB与同为茄科的番茄、马铃薯、烟草以及葡萄科的葡萄GAPB处于同一进化枝上,表现出较近的亲缘关系,其氨基酸序列同源性达到95%以上;荧光定量分析发现,CaGAPB基因可以被低温处理显著诱导表达,而其他的一些胁迫(NaCl,机械损伤,PEG,甘露醇)和信号分子(乙烯利,H_2O_2,SA)处理均会抑制其表达,同时非生物胁迫DC3000侵染对其表达无影响。综上所述,CaGAPB可能是同辣椒的低温抗性相关,其具体功能有待于进一步的研究。     

柠条锦鸡儿CkLEA4-1基因的克隆及表达分析

为研究胚胎发育晚期蛋白(LEA)在柠条中的生物学功能,从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制削减杂交文库中筛选到一条LEA蛋白编码基因,并采用RT-PCR法进行克隆。所得LEA基因的开放阅读框(ORF)长1 119 bp,编码373个氨基酸的蛋白质,命名为CkLEA4-1。结合序列比对与系统进化分析结果,推断CkLEA4-1属于5族LEA蛋白。利用实时荧光定量PCR技术对CkLEA4-1在干旱、高盐等逆境胁迫条件下的表达情况进行初步研究,结果表明,CkLEA4-1受到不同程度的诱导,推测该基因可能与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫有关。研究还成功构建了CkLEA4-1的过表达载体p Can G-CkLEA4-1,得到转基因纯合体株系,为进一步研究柠条锦鸡儿CkLEA4-1基因的功能提供了材料。     

扁蓿豆DNA甲基转移酶基因MrMET1的克隆及表达分析

DNA甲基化是一类重要的表观遗传修饰,在植物对非生物胁迫的响应中发挥重要作用。DNA的甲基化需要DNA甲基转移酶催化。为挖掘扁蓿豆中DNA甲基转移酶基因,解析其是否参与扁蓿豆抗逆性应答,本研究利用RT-PCR技术从扁蓿豆中克隆到1个胞嘧啶5-甲基DNA转移酶基因,该基因含1 071 bp的开放阅读框,编码357个氨基酸。生物信息学分析确定该基因为DNA甲基转移酶1 MrMET1基因。实时荧光定量PCR显示,MrMET1基因在不同非生物胁迫(低温,干旱, NaCl)及ABA处理下,不同时间表达量呈现不同的变化趋势,推测该基因参与了扁蓿豆对非生物胁迫的响应。本研究结果对深入解析METs基因的功能,理解牧草对非生物逆境胁迫响应机制具有一定的参考意义。     

玉米ZmCIPK20基因克隆及表达分析

CIPK蛋白激酶是植物非生物胁迫信号传导途径中的重要元件。为克隆玉米CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20全长c DNA序列,并分析其在盐胁迫下的表达模式,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的序列进行分析,采用荧光定量PCR方法研究ZmCIPK20在盐胁迫下的表达。本研究从玉米中克隆了一个编码CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20,该基因c DNA全长1 800 bp,5'-非编码区长203 bp,3'-非编码区长202 bp,编码区长1 395 bp,编码464个氨基酸,预测分子量为50.993 kD,等电点为8.55。推测的氨基酸序列中含有1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和1个NAF结构域。进化树分析发现,ZmCIPK20和SbCIPK分为一个分支。荧光定量PCR检测表明,ZmCIPK20基因受盐胁迫诱导表达,在根中下调表达,在叶中上调表达,说明玉米ZmCIPK20基因可能参与玉米对盐胁迫的应答,为揭示该基因的生物学功能提供依据。