烟草(Nicotiana tabacum)生长素响应基因NtIAA27的克隆及功能分析

为了研究内源生长素信号路径对烟草烟碱合成的调控,本研究根据烟草基因组数据和PCR扩增获得烟草生长素响应蛋白NtIAA27基因RNAi干扰片段180 bp,将该基因180 bp的片段克隆至RNAi载体pHellsgate12中,并通过叶盘法将该基因转入烟草K326中。经过实时定量PCR检测获得两株敲除效率较高的转基因植株,对这两株转基因株系及非转基因材料进行烟碱含量测定,结果表明与非转基因植株相比,RNAi转基因植株的烟碱含量升高,表明内源生长素信号路径可以负调控烟草烟碱含量,本研究将为培育不同烟碱含量的烟草品种提供有价值的信息。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

GFLVCP 基因 RNAi 载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果

为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

大豆持绿基因GmSGR的RNA干扰载体构建及遗传转化

持绿基因(Stay Green gene)在植物衰老过程中起到了重要的作用。本研究利用同源序列PCR方法、Gateway重组技术和子叶节遗传转化方法,对大豆持绿基因Gm SGR进行RNAi载体的构建,并将其转入到大豆受体中,获得转基因阳性植株。结果显示,分别获得长度为786 bp的Gm SGR1 CDS序列,长度为816 bp的Gm SGR2 CDS序列及355 bp的att B-Gm SGRi干扰片段。依据RNAi引物设计原则和Gateway重组技术,将干扰片段依次导入到入门载体p DONR221和表达载体p B7GWIW2(Ⅱ)中,并转化农杆菌EHA105,通过子叶节法将其转入大豆受体中,最终获得阳性转基因植株。本研究在m RNA水平沉默同源靶基因,干扰大豆Gm SGR基因功能,结果显示其叶片和种子有趋向持绿的特性。本研究为探究持绿基因的遗传效应,作用机理提供实践参考,为高光效大豆的遗传改良,探讨植物衰老延缓机制,提高产量和品质等提供理论支持。     

大豆低温诱导启动子GmERF9P的克隆及活性鉴定

为获得低温诱导基因GmERF9启动子,并分析该启动子的功能,利用PCR技术从大豆叶片基因组DNA中克隆1885bp的GmERF9启动子序列GmERF9P。序列分析表明,GmERF9P序列中含有多种与逆境相关的顺式作用元件。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草。通过PCR检测共获得6株T_1阳性转基因烟草株系。对野生型烟草和转基因烟草进行低温处理2h,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量。结果显示GmERF9P在低温处理下能够提高GUS基因的表达量,具有低温诱导启动活性。     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

大赖草6-SFT基因的克隆及其转基因烟草抗旱和抗寒性分析

果聚糖合成酶(6-SFT)在植物抵御逆境胁迫中起重要作用。利用RACE结合RT-PCR技术从大赖草(Leymus racemosus中克隆到6-SFT基因,其完整开放阅读框为1863 bp,被命名为Lr-6-SFT (GenBank登录号KT387273),编码620个氨基酸,其推导氨基酸序列含有保守的果糖基转移酶结构域。氨基酸序列比对及进化树分析表明,大赖草6-SFT与华山新麦草、普通小麦、西尔斯山羊草和大麦6-SFT具有高度相似性。采用基因重组技术构建p1300-35SN-Lr-6-SFT表达载体,利用农杆菌介导法将该载体转入烟草品种W38中。对经过抗性筛选、PCR和RT-PCR验证的转基因植株进行抗旱和抗寒性鉴定,发现转基因植株与对照相比,抗旱和抗寒性明显增强;在逆境胁迫条件下,转基因植株的果聚糖、可溶性糖、脯氨酸含量都显著高于对照,而丙二醛的含量显著低于对照。本研究表明,Lr-6-SFT基因是典型的GH32家族成员,, 2n= 4x = 28, NsNsXmXm)其表达能够提高烟草对干旱和寒冷胁迫的抗性。     

马铃薯HD-Zip Ⅰ家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子,在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯第1染色体,其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达,其根中表达量最高。q RT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、Na Cl和ABA诱导,受低温抑制。构建了由组成型表达启动子Ca MV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后,转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P0.05),而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P0.05);转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株;说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

转基因马铃薯外源基因插入位点分析及检测方法的建立

09-4为本实验室构建的抗马铃薯PRLV的RNAi基因和特异切割马铃薯PSTVd的核酶基因无标记双价表达载体p CAMBIA3301-DR-IS导入马铃薯中获得的转基因无性系。本研究通过染色体步移获取转基因无性系09-4的插入位点左边界旁侧序列,对获得的左边界序列进行分析,扩增获得片段大小为382 bp,包括转化载体序列119 bp及转基因马铃薯的旁侧序列263 bp;依据转化马铃薯的RNAi基因和左旁侧序列分别设计引物,扩增出大小为300 bp的片段,建立了09-4转基因无性系特异性标识和特异PCR检测方法,为转基因马铃薯的检测和身份识别提供技术基础。     

海藻糖酶基因RNA干扰载体对花烟草的转化

为了能够使花烟草更好地应用于园林美化,需要进一步提高其抵抗非生物胁迫的能力。海藻糖在植物抗逆性方面具有重要作用。利用RNA干扰技术抑制植物海藻糖酶基因的表达,可以阻断海藻糖降解过程,从而使植物体内海藻糖含量增加,有望以此提高植物抵抗非生物胁迫的能力。本实验利用叶盘侵染法将带有拟南芥海藻糖酶基因干扰载体(iTre-1285)的农杆菌导入花烟草中,经过抗生素筛选初步获得阳性植株后,对阳性植株提取DNA,完成了目的基因的PCR鉴定,初步证明目的基因已转入花烟草植株中。通过本试验,在建立起花烟草基因转化方法的同时,成功地将海藻糖酶干扰基因转入花烟草中。转基因花烟草植株的获得为后期能够进一步筛选出具有抵抗非生物胁迫的转基因植株奠定了基础。     

马铃薯StWRKY15在转基因烟草的耐寒性分析

WRKY转录因子在植物的正常生长发育以及逆境生长过程中起着重要作用.本研究以4℃作为低温胁迫水平,对'青薯9号'马铃薯组培苗进行胁迫处理.通过RT-qPCR技术对马铃薯的5个WRKY转录因子基因进行表达分析,筛选出对低温响应的基因,构建表达载体遗传转化烟草,初步分析基因的功能.结果 显示,4℃低温胁迫下,马铃薯中的StWRKY15基因上调显著(P＜0.05);STRING预测分析StWRKY15编码蛋白的互作蛋白,主要包括StWRKY72编码蛋白、StGRAS6编码蛋白、c2结构域QUIRKY蛋白;通过双酶切方法成功获得重组质粒PRI101-StWRKY15;冻融法介导转化烟草,过表达StWRKY15基因显著提高了转基因烟草的耐寒性.4℃低温胁迫下,StWRKY15基因的过表达明显增加了脯氨酸、可溶性糖及总蛋白含量,降低了丙二醛含量;胁迫10d时,转基因烟草的长势优于野生型烟草.综上所述,可推断出StWRKY15对低温胁迫有响应,在逆境胁迫下可减轻植株受到的损伤,在一定范围内增强转基因烟草的耐寒性.本研究为进一步了解马铃薯WRKY转录因子的功能提供了理论依据.     

超量表达CsADH17基因提高烟草抗旱性及香气成分分析

乙醇脱氢酶是植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中的关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用,因此探究CsADH17基因有利于茶树的生长发育与品质提升。以本课题组前期筛选的CsADH17基因为研究对象,克隆CsADH17基因并构建植物表达载体,遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下CsADH17的表达量和相关生理指标进行测定与分析。结果表明,对转基因与野生型烟草进行模拟干旱胁迫后,转基因烟草植株在干旱胁迫处理下的CsADH17基因相对表达量比野生型植株高。野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理21 d后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均高于野生型烟草;胁迫处理后,野生型烟草叶片中丙二醛(MDA)含量显著高于转基因烟草。香气成分分析,转基因烟草苯甲醛比野生型含量提高了44.4%,而烟碱含量比野生型提高不到5%。CsADH17基因在烟草干旱胁迫下具有抗旱作用,同时影响烟草的香气成分,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考。     

菊花DmDREBa/b基因提高转基因烟草耐逆性研究

本研究组前期从菊花(Dendranthema morifolium)中克隆得到两个DREB同源基因-Dm DREBa/b,发现两者都受到低温诱导。为了进一步探究该基因的功能,本研究通过农杆菌介导的叶盘转化法将Dm DREBa/b分别导入烟草,并对这两个基因进行了耐逆性分析。结果表明,在4℃低温处理下,过表达Dm DREBa和Dm DREBb基因的烟草的鲜重和存活率都显著高于对照,并且转基因烟草的MDA含量低于对照,而POD活性高于对照;在高盐胁迫下,过表达Dm DREBb基因烟草株系的鲜重、POD活性以及脯氨酸含量都显著高于对照和过表达Dm DREBa基因烟草株系,并且过表达Dm DREBb烟草的存活率达到53%,显著高于对照的存活率20%;而对转基因烟草进行干旱胁迫后,过表达Dm DREBa烟草株系鲜重、POD活性和脯氨酸含量则均显著高于对照和过表达Dm DREBb烟草,且有60%的过表达Dm DREBa烟草恢复生长,显著高于对照(13%)和过表达Dm DREBb烟草(27%)。因此,本研究进一步证明菊花Dm DREBa和Dm DREBb基因均参与低温胁迫调控网络途径,能够提高转基因烟草耐低温能力,其中,Dm DREBa表现为更加积极调控转基因烟草的干旱胁迫,而Dm DREBb则更可能参与响应转基因烟草的高盐胁迫。     

水稻OPR基因的克隆及其在烟草中抗镉性分析

12-氧-植物二烯酸还原酶是茉莉酸生物合成途径的一个关键性酶,广泛参与植物生长过程中生物与非生物胁迫。本研究主要探讨OPR基因在植物非生物胁迫中的作用。从水稻中克隆了OPR基因,该基因的cDNA编码区全长1 203 bp,编码400个氨基酸,将其连接到植物表达载体pSH 737上,通过农杆菌介导的方法,将含有目的基因的载体遗传转化烟草,获得31株转基因植株。选取生长状况基本一致的8株不同转基因株系和4株野生型烟草,在非生物胁迫下,用300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液浇灌处理,观察植株生长并对抗镉能力进行初步分析;选取T 1代3个转基因株系(TP 7、TP 8和TP 12)和野生型烟草的种子,放入含有3个不同浓度CdCl_2溶液的滤纸上萌发进行镉胁迫并统计发芽率。在300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液胁迫15 d后,种子发芽率比野生型高40%以上,转基因烟草的抗氧化酶活性显著高于野生型,丙二醛的含量显著低于野生型植株。利用RT-PCR方法分析相关基因表达情况,结果表明,在Cd~(2+)胁迫下,OPR,Snakin-2和GRP-2基因表达均上调,因此推测OPR基因的高表达是其具有高抗性的主要原因。OPR基因的过量表达使烟草提高了对重金属Cd~(2+)的抗逆性能力。     

棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因GarTHA的克隆及功能验证

盐胁迫是影响作物生长和发育的重要因素之一。一些棉属野生种具有较好的耐盐性, 是开展棉花耐盐性机制研究以及改良陆地棉耐盐性的重要资源。本研究基于cDNA-AFLP技术分离获得的旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫下差异表达片段序列信息, 经电子克隆技术和RT-PCR方法克隆了旱地棉苏氨酸醛缩酶基因cDNA全长, 命名为GarTHA (GenBank登录号为KC167360)。该cDNA全长为1 018 bp, 包含一个822 bp的完整ORF, 编码273个氨基酸残基, 蛋白质分子量为82.57 kD, 等电点为4.89。GarTHA基因与杨树PtTHA基因同源性最高, 为84.6%。为进一步验证其功能, 利用拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体, 将GarTHA基因的完整ORF转入拟南芥中, 获得转基因植株并进行了耐盐性鉴定。结果表明, 在盐胁迫下转基因拟南芥种子的发芽率明显高于野生型, 且转基因植株的根长显著高于野生型。说明GarTHA基因可能参与植物的盐胁迫反应, 从而提高植物抗逆性。     

农杆菌介导的辽宁碱蓬胆碱单氧化酶基因CMO转化烟草提高抗氧化胁迫的研究

通过农杆菌介导的遗传转化,将来自辽宁碱蓬的甜菜碱合成关键基因－胆碱单氧化酶基因CMO 转入烟草,以提高烟草耐受氧化胁迫的能力,并对得到抗生素抗性植株进行了分子检测和百草枯诱导 的氧化胁迫。Southern 和Northern 检测表明CMO 已经整合到烟草基因组中,并得到了正确的表达,但 不同转基因株系中的拷贝数不同,株系T1、T2、T6 为单拷贝;株系T4、T5 为双拷贝;株系T3 为3 个拷 贝。在10 μM 和20 μM百草枯胁迫24 h 的情况下,转基因植株表现了较强的耐受氧化胁迫能力,各转 基因株系和野生型相比具有较低的丙二醛含量和较高的超氧化物歧化酶活性。这可能是转基因植物 中甜菜碱的积累诱导或保护了抗氧化酶的活性,使得转基因植株受到的氧化胁迫较低,转基因植株中 较低的电导率也证明了这一点。转CMO 基因烟草耐氧化胁迫能力的提高,说明CMO 基因可以进一步 在玉米、水稻等重要农作物中应用以提高其耐受干旱、低温等非生物胁迫的能力。