巴西橡胶树HbMADS5的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,通过PCR克隆了1个编码巴西橡胶树MADS-box转录因子的基因,命名为Hb MADS5。Hb MADS5全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测Hb MADS5蛋白分子量为40.75 k D,等电点为6.38。氨基酸序列比对分析表明,Hb MADS5具有MADS-box家族典型的MADS-box保守结构域,与蓖麻、葡萄、麻风树、甜橙、木本棉、蒺藜状苜蓿等物种的MADS-box家族成员具有较高的同源性,分别为79%、74%、72%、70%、65%和59%。Hb MADS5与麻风树中的1个MADS-box成员亲缘关系最近。Hb MADS5在巴西橡胶树根、茎、叶、花和胶乳等中都有表达,其中在胶乳中表达量最高,在根中表达量最低;茉莉酸甲酯和乙烯能诱导Hb MADS5的表达,茉莉酸甲酯处理12 h后Hb MADS5表达量提高了10倍,乙烯处理48 h后Hb MADS5表达量提高了2倍。本研究将为进一步研究Hb MADS5在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的克隆与表达分析

为阐明巴西橡胶树WRKY转录因子基因Hb WRKY41的分子特征及表达特性,利用RT-PCR方法从巴西橡胶树中克隆了该基因。Hb WRKY41开放阅读框1 020 bp,编码339个氨基酸,预测蛋白分子量为38.48 k Da,理论等电点为5.52。Hb WRKY41含有1个WRKY保守结构域和1个C_2HC型锌指结构,与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥WRKY41蛋白聚为一类,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR检测结果表明,Hb WRKY41在巴西橡胶树根、树皮、胶乳、叶和花等组织中均有表达,以在衰老叶片中的表达最高,而在胶乳和树皮中的表达相对较低。干旱、低温及高盐胁迫均可上调Hb WRKY41的表达,其中以低温或盐胁迫下Hb WRKY41的表达持续升高。Hb WRKY41可能在巴西橡胶树叶片衰老和非生物胁迫应答中起着重要调控作用。     

巴西橡胶树产胶基因HbREF、HbHMGR1与MYCs转录因子互作

天然橡胶主要来自巴西橡胶树,巴西橡胶树是海南省主要的经济作物之一。胶乳在乳管中合成储存,乳管数量影响胶乳产量。乳管分化一直被证明与茉莉酸信号途径相关,本实验室已在前期研究中鉴定了茉莉酸信号途径中的关键转录因子MYCs与G-box顺式作用元件的互作,为了验证HbMYCs是否与含G-box(CACGTG)顺式作用元件的产胶相关基因互作,本研究克隆了两个产胶相关基因HbREF与HbHMGR1的全长启动子序列,并设计了相应的单荧光素酶报告基因实验,经生物信息学分析发现,2个基因的启动子上均含G-box (CACGTG)顺式作用元件,单荧光素酶报告基因实验的结果表明,HbREF和HbHMGR1分别与Hb MYC2、Hb MYC3、Hb MYC4互作,且受HbMYCs转录因子的正向调控,说明茉莉酸信号通路中的转录因子可以调控橡胶产排胶基因的表达,对阐明橡胶树产排胶机理具有重要意义。     

棉花GhWRKY106-1的克隆与表达分析

为了研究WRKY转录因子对棉花抗枯萎病的作用机理,发掘抗枯萎病基因资源,本实验以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选出的WRKY基因片段为探针,利用电子克隆结合RT-PCR技术,从陆地棉"中棉所12"根部c DNA克隆得到一个WRKY基因,命名为Gh WRKY106-1(登录号:KP202869)。序列分析表明,该基因开放阅读框全长918 bp,编码306个氨基酸,含有1个WRKY结构域和一个典型的C2HC锌指结构,属于典型的第Ⅲ类WRKY家族转录因子。q RT-PCR检测该基因在"中棉所12号"中的表达特性结果分析表明:枯萎病菌诱导后,该基因的表达量表现出先升高后降低的趋势,并且在处理后3 h基因的表达量达到最大。激素处理:茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和乙烯(ET)胁迫后Gh WRKY106-1基因表达量均发生变化,其中茉莉酸在处理后4 h基因的表达量达到最大,而水杨酸和乙烯诱导响应最强烈的时间均在3 h;并且水杨酸诱导Gh WRKY106-1基因的表达较茉莉酸强烈,而乙烯的表达量在处理前期又明显高于水杨酸和茉莉酸,因此推测该基因在棉花对枯萎菌的抗性反应中起着一定作用,可为今后棉花抗枯萎病研究提供依据。     

巴西橡胶树JAZ家族基因的克隆和表达分析

茉莉酸是调控橡胶树创伤反应及产排胶的重要激素,JAZ蛋白是茉莉酸信号途径中重要的负调控因子。目前,巴西橡胶树中已报道7个JAZ基因。本研究结合Genebank中已有的橡胶c DNA序列和本实验室转录组测序数据,通过电子克隆的方法获得5个橡胶JAZ基因全长序列,分别命名为HbJAZ3、HbJAZ4、HbJAZ5、HbJAZ6和HbJAZ12,并通过RT-PCR技术成功扩增得到HbJAZ3、HbJA5、HbJAZ6、HbJAZ12等4个基因的编码区。最后采用定量RT-PCR技术分析发现,4个橡胶JAZ基因在橡胶不同组织中的表达有明显,以及其在伤诱导和茉莉酸处理后的差异表达,发现4个橡胶JAZ基因的表达都受到茉莉酸及创伤处理的影响,说明这些JAZ蛋白参与橡胶茉莉酸调控的创伤反应,本研究为阐明橡胶产排胶调控机理打下基础。     

巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳cDNA文库的构建

摘要：以巴西橡胶树热研7-33-97为材料,对橡胶树割线下方施用0.1%茉莉酸,采集胶乳,提取胶乳总RNA并纯化mRNA,构建巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳融合表达文库。检测表明,获得的初级文库滴度为1.9×106 pfu/ml,插入片段在0.5到5kb之间,平均大小为1kb左右;表明该文库质量合格,为今后克隆胶乳中的茉莉酸信号应答基因奠定基础。     

橡胶树HbICE1的克隆及表达模式分析

低温是影响植物正常生长发育,导致作物产量和品质下降的主要自然灾害之一。由于橡胶树(Hevea brasiliensis)属于热带植物,不耐寒,所以极易受到低温冷害影响。而Inducer of CBF expression 1(ICE1)是低温胁迫信号通路中的重要转录激活因子,目前橡胶树冷胁迫信号途径中包括Hb ICE1在内的大部分关键基因的研究还比较匮乏。我们从橡胶树中克隆了Hb ICE1基因。经测序发现,该基因开放阅读框为1 407 bp,编码469个氨基酸,蛋白质分子质量约为51 k D,理论等电点(p I)为5.83,为亲水性蛋白。并且利用荧光定量PCR技术分析了Hb ICE1在不同激素(乙烯,脱落酸,茉莉酸)以及H2O2处理后的表达模式,结果表明乙烯、脱落酸、茉莉酸以及H2O2均能调控橡胶树Hb ICE1基因的表达,但不同胁迫处理下的表达模式存在着较大的差异,暗示着Hb ICE1在不同的激素信号途径中发挥的作用差异较大。     

巴西橡胶树REF/SRPP家族基因的克隆及表达分析

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳是天然橡胶的主要来源,橡胶延伸因子(REF)和小橡胶粒子膜蛋白(SRPP)作为胶乳中的两大主要蛋白,被认为参与了橡胶的合成和调控。目前,NCBI蛋白数据库已经登录了巴西橡胶树REF/SRPP家族的6个成员,我们通过研究又获得8个新的REF/SRPP基因家族成员,Hb REF154、Hb REF221、Hb REF296、Hb REF542、Hb SRPP178、Hb SRPP203、Hb SRPP216、Hb SRPP234。这14个成员编码蛋白都具有保守的REF结构域,有两个成员还具有ATP合酶亚基结构域,一个成员具有甲基结合结构域。进化分析显示橡胶树REF/SRPP家族成员与产胶植物REF/SRPP家族成员在进化上较为接近。q PCR分析发现该家族成员都响应割胶刺激表达升高,除Hb REF138外其它成员都响应乙烯处理表达降低。通过shotgun数据分析发现,除Hb REF221外的13个成员都存在于橡胶粒子或C-乳清组分中,Hb REF138、Hb REF154、Hb REF175和Hb REF258主要存在于橡胶粒子中,Hb REF542、Hb SRPP216是橡胶粒子中所特有的,Hb REF296和Hb SRPP200是C乳清中所特有的。该研究结果揭示了REF/SRPP家族成员及其基本的表达特性,为深入研究该家族成员在巴西橡胶树产胶中的具体作用提供了一定的基础。     

巴西橡胶树伤害诱导蛋白基因的克隆及表达分析

为了研究橡胶树在逆境胁迫下的分子机制,根据巴西橡胶树抑制消减(SSH)文库和NCBI数据库中的伤害诱导蛋白基因拼接序列设计嵌套引物,通过RACE技术获得基因的完整开放阅读框,命名为HbWUN1。序列分析表明HbWUN1长872 bp,含有390 bp的开放阅读框,编码129个氨基酸。生物信息学分析结果表明HbWUN1不含信号肽和跨膜结构,为亲水性蛋白。进化分析结果显示,橡胶树HbWUN1与拟南芥NP_974279.1聚成一类。RT-PCR分析结果表明HbWUN1表达无组织特异性,在胶乳中表达量最高。在叶片不同发育时期HbWUN1表达存在变化,在衰老期最高。此外,低温、伤害、高盐、乙烯和茉莉酸处理均调控HbWUN1表达,推测其可能在橡胶树逆境反应中发挥作用。     

橡胶树品种‘湛试327-13’乙烯响应分子机制分析

橡胶树‘湛试327-13’新品种兼具抗寒和高产的特性,揭示其在乙烯刺激后的分子机制有利于精准鉴定和选育种质资源。本研究以1.5%乙烯利处理橡胶树‘湛试327-13’开割树为材料,利用荧光定量技术分析胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白和橡胶生物合成关键酶等基因的表达规律,结果表明：乙烯利处理并连续割6刀后,橡胶树活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因在树皮表达量高于其在胶乳中表达量。与对照相比,随着割胶刀数的增加,‘湛试327-13’树皮脂肪氧化酶(HbLOX1)和过氧化物酶基因(HbPOD1)基因表达显著上调,最高为22.15和31.95倍;蔗糖转运蛋白HbSUT1、HbSUT2a分别提高66.11和58.50倍;几丁质酶(HbCHI)、葡聚糖酶(HbGLU)和橡胶素(HbHEV)分别提高16.93、8.09和10.37倍;橡胶生物合成关键酶基因HbGGPPS和HbHMGS1分别提高了14.71和15.05倍。说明乙烯刺激橡胶树后,‘湛试327-13’胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因依次高表达且持续时间长达6刀(18 d...     

巴西橡胶树NAC转录因子HbNAC1基因的克隆及生物信息学分析

为了研究植物特有的NAC(NAM,ATAF1/2和CUC2)转录因子在巴西橡胶树生长发育、胁迫应答和激素调节中的功能,对巴西橡胶树NAC转录因子进行了克隆和分析。根据橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,利用RACE-PCR技术克隆了橡胶树HbNAC1的cDNA序列。生物信息学分析显示HbNAC1基因开放阅读框(ORF)为891 bp,编码了一个296个氨基酸组成的中性不稳定水溶性蛋白,该蛋白的N-端具有保守的NAC结构域,C-端高度变异,具备了NAC转录因子的基本特征。HbNAC1定位在细胞核中,具有3个糖基化位点和21个磷酸化位点,三级结构由3个α-螺旋和9个β-折叠组成。序列比对和系统进化分析显示HbNAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族,推测其可能作为一种氨基酸合成相关的调节酶参与调控植物的免疫反应。     

棉花抗枯萎病相关转录因子基因GhERFB101的克隆与表达分析

为了探究ERF转录因子家族与棉花枯萎病抗性之间的关系,也为海岛抗枯萎病品种的选育工作提供新的基因资源,从Solexa高通量测序技术建立的棉花基因表达谱中筛选探针序列,通过电子克隆结合RT-PCR技术从高抗枯萎病的棉花品种中棉所12中克隆到一个新的ERF-B1亚组转录因子基因,命名为Gh ERFB101(Gen Bank:KF850521)。序列分析表明,该基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域,在进化上与拟南芥At ERF11的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,枯萎病菌诱导后,Gh ERFB101基因在抗病品种根中的表达量呈现下降趋势;而在感病品种中,该基因呈上调表达,随着病菌处理后时间延长,其表达量呈现先增加后降低的变化趋势,在病菌处理后12 h表达量达到最大,在48 h下降到最低。乙烯和茉莉酸诱导后,该基因表达量均呈现明显的先增加后降低的变化趋势,在乙烯处理后2 h基因的表达量达到最大;茉莉酸则在处理后1 h基因的表达量达到最大;而水杨酸诱导后基因的变化幅度不大;推测该基因可能通过茉莉酸、乙烯信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是细胞内最重要的且具有高度选择性的蛋白质降解途径,而泛素结合酶E2/UBC是该途径的一个关键酶。本研究通过对巴西橡胶树同源EST序列拼接和RT-PCR扩增的方法,克隆了一个巴西橡胶树的泛素结合酶基因HbUBC22,该基因的开放阅读框（ORF）共807 bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有一个保守的UBC结构域和一个高度保守的半胱氨酸催化位点。系统进化关系分析发现,HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白的同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%;在拟南芥基因组中,HbUBC22则与AtUBC22的同源性最高达到73%。表达谱分析结果显示,HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。原核表达分析结果表明,经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。本研究结果为进一步研究HbUBC22在橡胶树中的生物学功能奠定了良好基础。     

三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析

为了揭示三七抗病防卫反应的调控机制,对三七的一个NAC转录因子的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。以一年生三七幼苗为材料,根据编码NAC转录因子的三七转录组Unigene设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的NAC转录因子基因,命名为PnNAC1。序列分析表明,该基因全长815 bp,含有24 bp的5'非翻译区和215 bp的3'非翻译区,以及576 bp开放阅读框,共编码191个氨基酸,具有保守的NAC结构域。实时荧光定量PCR结果显示茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的转录水平,接种茄腐镰刀菌后,PnNAC1的表达进一步上升,在接种后4 h转录水平达最大值;无菌水预处理的三七中,PnNAC1也快速响应茄腐镰刀菌的侵染,但表达水平明显低于茉莉酸甲酯预处理的样品。接种人参链格孢后PnNAC1在叶片的表达量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和过氧化氢4种信号分子处理三七根部均诱导PnNAC1的表达。表明PnNAC1响应几种逆境相关信号分子,并参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。     

橡胶树一个胶乳高表达MDR型ABC转运蛋白的克隆与表达研究

ABC转运蛋白（ATP-Binding Cassette）是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族之一,与植物次生代谢物的排泌、积累及跨膜运转密切相关。本研究筛选已构建的乙烯刺激橡胶树胶乳消减文库,克隆了1个ABC转运蛋白基因EST,通过RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因开放阅读框（ORF）共3753 bp,编码1251个氨基酸残基。研究表明其在橡胶树基因组中存在多个拷贝,主要在胶乳中表达,且在乙烯或茉莉酸刺激（刺激产胶）条件下上调表达。推测其可能与橡胶生物合成过程中的物质运输密切相关。     

木薯EIN3基因的序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性

木薯是一种重要的能源和淀粉作物,具有较强的抗逆性和耐贫瘠等能力。为研究木薯中EIN3基因如何被逆境信号调控,对木薯基因组数据库中的EIN3基因进行了序列分析,表明其具有典型的EIN3-like protein DNA结合结构域;其启动子区具有茉莉酸响应元件等多种响应元件。本研究以木薯品种"华南八号"悬浮培养细胞为材料,利用q RT-PCR检测木薯EIN3基因在乙烯利和茉莉酸甲酯处理后的表达特性。结果显示:EIN3在乙烯处理后,基因表达在8 h内呈现持续上升趋势;而茉莉酸甲酯处理后则整体呈现先上升后下降的趋势,且在2 h基因表达量最大。说明EIN3基因可被乙烯和茉莉酸信号调控,并推测其可受不同激素信号的整合后的综合调控,可参与到植物体内一系列多种生理生化过程。     

过表达αNAC基因抑制木薯蔗糖合酶Ⅰ基因的转录活性

木薯是世界第三大薯类作物,所产淀粉广泛用作食品和工业原料,是重要的粮食和经济作物。木薯蔗糖合酶是将光合同化物蔗糖向淀粉转化的第一个关键酶,前期本课题组通过酵母单杂交分析发现αNAC可能是木薯蔗糖合酶Ⅰ基因的调控因子,本研究在此基础上获得了αNAC基因转录序列并克隆其编码序列,发现编码蛋白具有典型的NAC和UBA保守结构域。αNAC基因在木薯地上部叶和地下部块根肉中转录活性较高,为β-actin基因的5%~25%,在施用外源激素条件下转录活性显著上调,其中茉莉酸达到峰值时间最短,水杨酸次之,乙烯、脱落酸、赤霉素和生长素较长。此外,在MeSuSy1Promoter::GUS的转化株中二次过表达αNAC基因,发现二次转化株中GUS酶活显著低于单价转化株,表明过表达αNAC基因可以显著抑制木薯蔗糖合酶Ⅰ基因的转录活性。     

巴西橡胶树HbRPB11基因的克隆与表达分析

橡胶树树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。生产上施用乙烯利通过延长橡胶树割胶后的排胶持续时间,调节胶乳代谢,从而达到增产的目的。但目前对于转录复合体关键成员RNA聚合酶Ⅱ在胶乳代谢过程中的动态变化尚不清楚。本研究采用RACE和RT-PCR方法,从橡胶树无性系CATAS7-33-97的胶乳中克隆到编码RNA聚合酶Ⅱ关键亚基RPB11的同源基因,命名为HbRPB11。该基因全长659 bp,包含351 bp的开放阅读框,编码一个由116个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为13.53 k D,理论等电点为5.934。实时荧光定量PCR结果表明,HbRPB11在橡胶树的多个组织中均有表达,其中在成熟叶片和胶乳中的表达量最高,并且受割胶和乙烯利处理显著上调。橡胶树不同种质间的表达模式分析显示HbRPB11基因在橡胶合成效率高的种质中的表达量要显著高于橡胶合成效率低的种质,表明该基因的表达量与橡胶合成效率呈正相关性,有可能作为生产上筛选高效合成橡胶种质材料的分子标记。