甜瓜CmERFV-4基因cDNA克隆及特性分析

乙稀应答因子(ethylene-responsive factor,ERF)是乙烯信号通路中的组分之一,通过认别并结合下游功能基因启动子顺式作用元件GCC-box,从而实现对植物发育的调控和逆境胁迫的响应。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜为研究材料,从成熟甜瓜果实中克隆得到554 bp的CmERFV-4基因cDNA,基于该cDNA序列,进行了蛋白理化性质、空间结构与系统进化分析。实时荧光定量PCR检测表明,在不同组织检测结果中CmERFV-4基因在子叶中的表达量最高,在不同发育阶段果实检测结果中该基因在授粉后40 d果实中的表达量最高。构建了该基因超表达载体和RNAi载体。     

甜瓜PGIP基因的克隆及表达初步分析

以甜瓜叶片基因组DNA为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长978 bp的目的片段。该基因包含有1个完整的开放阅读框,没有内含子,编码326个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列比对表明:该基因编码的氨基酸序列与GenBank中的PGIP基因氨基酸序列(AAP41199)同源性为100%;RT-PCR表达分析表明,该基因在甜瓜叶、茎、根、果实中表达,在花中不表达。为植物分子抗病育种提供了1条基因资源。     

3个陆地棉球蛋白基因启动子的克隆与功能初步分析

为克隆陆地棉来源的种子特异性启动子,根据雷蒙德氏棉测序结果,设计针对GhαGLOA、GhβGLOA和GhβGLOB基因编码区上游约1.5 kb序列的引物,分别以陆地棉总DNA为模板克隆了3条序列。构建了含有编码区上游序列驱动GUS的表达载体,经农杆菌介导转化野生型拟南芥。转基因拟南芥种子的GUS活性荧光检测结果表明,所克隆序列具有启动子功能,其中GhαGLOA启动子的转录活性极显著高于其他2个启动子。在转基因拟南芥成体植株的多个器官中,仅可检出痕量的GUS活性,认为所克隆启动子为种子特异性启动子。     

甜瓜CmDWF1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是调节植物生理活动的重要植物激素,DWF1是油菜素内酯合成途径中重要的合成酶之一。为了研究油菜素内酯合成酶基因DWF1在甜瓜果实发育过程中的功能,从甜瓜中克隆得到CmDWF1基因,并对该基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR方法分析了该基因在甜瓜不同组织器官中的表达。结果表明:CmDWF1基因的开放阅读框片段长为1 701 bp,编码566个氨基酸,预测其编码蛋白的分子质量为66.115 11 ku,理论等电点为6.96,不稳定指数为48.18,总平均亲水性为-0.402,属于亲水性蛋白。CmDWF1蛋白含有FAD-binding-4结构域,推测其具有FAD氧化还原酶特性。该蛋白信号肽序列,在细胞质中的定位系数为9,推测其主要在细胞质中分布。二级结构预测显示,CmDWF1蛋白中α-螺旋的含量相对较高,为37.81%。系统进化分析表明,CmDWF1蛋白与黄瓜的亲缘关系较近;实时定量PCR结果表明,该基因在甜瓜的根、茎及叶中均有表达,但在根中表达量最高,并且在甜瓜果实授粉后25 d内表达量有明显的上升,35～45 d内表达量呈下降趋势。由以上结果可知,CmDWF1基因可能参与甜瓜油菜素内酯的合成,并进一步调节甜瓜的生长发育。     

水稻新基因OsJT1的克隆及功能初步分析

水稻(Oryza sativa L.)生长发育与其体内的激素调节密切相关,本研究从水稻野生型黎榆B(O.sativa L.ssp.japonica C.V.Liyu B)基因组中克隆了一个与激素调节相关的新基因OsJT1。生物信息学分析表明:水稻OsJT1基因cDNA全长650 bp、编码216个氨基酸;OsJT1蛋白的理论分子量为22.99 kD,等电点为7.68,是亲水性的稳定蛋白;OsJT1蛋白的二级结构中,9个α-螺旋,16个无规则卷曲,10个B折叠,5个β转角。本研究构建了融合表达载体(p Ca MV35S::OsJT1:EGFP),通过农杆菌介导法获得OsJT1过表达株系,性状分析表明:过表达株系的株高和结实率下降、叶宽增加,且结实率和叶片宽度与野生型差异均达到显著水平(p0.05)。根据生物信息学及过表达转基因植株的表型分析内容,初步推断该基因可能与激素调节相关。     

一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析

通过陆地棉高品质纤维种质系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序,得到一个开放阅读框(open reading frame,ORF)完整的棉纤维表达蛋白(GhCFE,GenBank登录号:DQ073045)cDNA序列。该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码332个氨基酸,其理论上的等电点pI=6.14,分子量Mw=37.7KD。它的N-末端存在一个长度为27个氨基酸残基的信号肽。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎中不表达,在叶片中微弱表达,在不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在纤维伸长期表达量最高。进化树显示GhCFE与已报导的3个棉纤维表达蛋白cDNA有很高的同源性。通过构建酵母表达载体,发现该基因对酵母细胞的伸长和细胞壁加厚没有显著影响。利用pBI121质粒构建了含35S启动子的正义表达载体和含棉纤维特异表达启动子E6的正义和反义表达载体,正在通过农杆菌介导的遗传转化,开展该基因的功能验证。     

棉花GhTGA2.1基因的克隆表达及功能的初步分析

为了获得棉花GhTGA2.1基因并分析其生物学功能,本研究通过分析枯萎病菌诱导的棉花转录因子,获得1个TGA转录因子基因,命名为GhTGA2.1。该基因ORF全长为1 389 bp,编码462个氨基酸,序列比对发现GhTGA2.1具有碱性结构域(N-x7-R/K-x9)、亮氨酸拉链结构域(L-x6-L-x6-L)和1个保守的DOG1结构。Gh TGA2.1基因编码蛋白分子量为51.12 kD,理论等电点为7.88,为亲水的不稳定蛋白,二级结构主要为无规则卷曲和α螺旋。利用实时荧光定量RCR技术(RT-qRCR)分析基因表达水平,发现棉花枯萎病菌诱导GhTGA2.1基因的下调表达;经SA、JA和ET处理后,GhTGA2.1基因表达量相对于mock发生显著变化。为进一步研究该基因功能,构建GhTGA2.1基因过表达载体并进行烟草遗传转化,获得6株转GhTGA2.1基因阳性植株,其抗病相关基因NtPR1、NtPR5、NtNPR1和NtERF1表达量明显低于野生型株系,其中NtPR1和NtPR5的相对表达量下降幅度较大;而NtPR4和NtWRKY70的表达量升高,NtPR2的表达量较野生型没有...     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

猪MAPK12基因cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆新的猪MAPK12基因全长ORF，分析其生物特性，为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法：以已报道的人及小鼠MAPK12基因cDNA序列为依据，利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物，RT-PCR技术扩增新的猪MAPK12基因ORF序列，将PCR产物直接进行序列测定。分析此蛋白的特性并预测其结构。结果 分离的ORF全长1101bp，编码367个氨基酸，与人鼠氨基酸序列92%同源；利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级、二级和高级结构。结论 研究分离的基因片段可命名为猪ERK6，通过分析，获取了该酶的基本信息特征，并与现有的报道结果进行对比分析，为进一步开展猪MAPK12基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析

以蓝色风信子完全露出蓝色的花蕾为材料,利用RT-PCR和RACE技术,获得风信子DFR基因的全长cDNA。该cDNA全长1252 bp ,开放阅读框为1098 bp ,编码366个氨基酸。 Blast搜索结果显示,风信子DFR基因核苷酸序列与其它植物已报道的DFR基因具有66 %～77 % 的相似性,氨基酸序列有62 %～73 %的相似性。聚类分析表明, 最先与风信子聚类合并的是鸢尾,其次与其它单子叶植物聚类,最后与双子叶植物聚类。     

矮牵牛自交不亲和性基因sx的克隆及功能初步分析

利用NCBI、CODEHOPE、Primer Premier5.0等数据库和生物软件设计兼并引物,以矮牵牛花柱cDNA为模板,利用RT-PCR扩增到1条长为417 bp的序列,在GenBank中比对发现,该序列与SX基因相似性最高。然后以SX序列为模板设计特异性引物,RT-PCR扩增到1条全长为747 bp的目的片段,测序结果分析表明,该基因核苷酸序列开放阅读框全长660 bp,编码220个氨基酸,其中包括有22个氨基酸的跨质膜信号肽区,和5个保守区(C1-C5)以及2个高变区(Hva, Hvb),据前人研究所知,该基因具有S-核酸酶功能。同时,从番茄DNA中克隆到一长为717 bp的花粉特异性启动子LAT52。为了使SX基因能在花粉中发挥其S-核酸酶功能,去掉22个氨基酸跨质膜信号肽(命名为sx)之后,与番茄花粉特异性启动子LAT52嵌合构建植物表达载体并转化拟南芥。 TTC染色结果表明,LAT52能特异性的在花粉中调控sx基因的表达,使花粉活力很低甚至没有活力,从而使转基因植株不育。     

油茶CoUXS1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

为了揭示油茶UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因的序列特点和结构功能,为该基因的深入研究和开发应用奠定基础。根据油茶种子EST文库中调取的UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因序列,设计特异引物,利用RT-PCR技术获得该基因全长cDNA克隆,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：该基因阅读框为1032 bp,编码344个氨基酸,具有典型的UXS家族模体序列。与海岛棉GhUXS3基因亲缘关系最近,定位于细胞质,有较强的亲水性,将该基因命名为CoUXS1,GenBank登录号为JN017094。     

金花茶CnBCH基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

利用CODEHOP和RACE方法,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了β-胡萝卜素环羟化酶(β-carotene hydroxylase,BCH)基因的cDNA全长,命名为CnBCH。碱基序列分析结果表明,该CnBCH基因全长1 089 bp,包含58 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、105 bp的3'UTR和927 bp编码308个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质为不稳定亲水性蛋白,分子量为34.42 k D,无信号肽,含有4个跨膜结构域,一个脂肪酸羟化酶超家族(FA_hydroxylase super family)功能结构域以及BCH功能结构域(PLN02601);CnBCH二级结构以α-螺旋为主,其次为无规则卷曲,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnBCH与茄科、蔷薇科等植物BCH蛋白同源性都在70%以上,与柿树(Diospyros kaki T.)BCH同源性最高。本研究为进一步了解CnBCH基因的功能及其在金花茶花瓣类胡萝卜素合成中的作用提供了帮助。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E. coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79% ,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank (Accession. EF624459)     

甜瓜品种河套蜜瓜ACC氧化酶基因1(ACO1)全长cDNA的克隆及序列分析

根据GenBank上登录的甜瓜ACC氧化酶基因1 (Cm-ACO1)序列,设计特异性引物,应用RT-PCR从甜瓜品种河套蜜瓜成熟果实中克隆得到了ACO1的全长cDNA,共1 035 bp,并对其进行了序列分析,结果表明,所克隆的cDNA与已报道的甜瓜品种Cantaloup charentais的ACO1 cDNA序列完全一致.该基因的克隆为进一步研究 ACC氧化酶基因在甜瓜中的表达特性以及功能奠定了基础.     

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。     

小麦小G蛋白Tarab5B基因全长cDNA克隆及表达特性的初步分析

通过对白粉病菌诱导的小麦叶片cDNA文库的测序,获得1个与水稻Rab5B基因一致性达89%的序列.以该序列为信息探针,筛选小麦EST数据库并进行电子拼接.根据拼接结果设计引物,利用RT-PCR方法获得了1个小麦中尚未鉴定的全长cDNA克隆Tarab5B.Tarab5B基因编码的蛋白具有结合GTP/GDP的4个保守结构域以及Rab家族成员所特有的结构域.同源分析表明,该基因属于Rab5B亚族.麦类Rab5B蛋白的GDSGVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA和MGCSSS 5个结构域在进化上非常保守,而YYRGA结构域及其邻近的C端6个氨基酸残基在小麦材料间同源性很低.RT-PCR检测显示,抗、感两个材料Tarab5B基因在接种后24 h和未接种24 h的表达水平基本相同;在接种后1 h、4 h、7 h、12 h,抗、感两个材料间Tarab5B基因的表达水平有一定差异.