野生黄毛草莓NAC转录因子基因FnNAC7克隆与表达分析

NAC转录因子基因为植物所特有,在植物的生长发育、非生物和生物胁迫的抗逆反应中起着重要作用。本研究以野生黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schidl.)为材料,利用RT-PCR技术,从中克隆到1个NAC转录因子基因FnNAC7 (GenBank登录号:MK685675)。序列分析结果表明,FnNAC7开放阅读框为1 137 bp,编码378个氨基酸,包含一个保守的NAM结构域。同源性分析结果表明,FnNAC7基因编码的氨基酸序列与森林草莓编码的氨基酸相似性为94.87%。蛋白结果预测显示,FnNAC7蛋白为不稳定的酸性疏水蛋白,不存在跨膜结构域,且无信号肽存在;亚细胞定位试验结果显示,该基因编码的蛋白质在细胞核中表达;实时定量PCR结果显示,接种草莓尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)后,草莓叶片FnNAC7基因表达上调,接种24 h后该基因表达量最高,是对照组的17.0倍。研究结果为进一步深入开展NAC基因在草莓炭疽病抗性中功能分析和分子育种提供了科学的依据,也为进一步研究FnNAC7基因在野生黄毛草莓抗草莓炭疽病中所起的调控作用提供了参考。     

南瓜CmNAC基因片段的克隆与序列分析

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子,其家族成员N端含有保守氨基酸序列,C端为高度变异的转录激活区。本项研究以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC、辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440 bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,而后对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析,结果表明所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC。该基因片段具有其他植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。     

辣椒HD-Zip转录因子家族鉴定与生物信息学分析

从辣椒基因组数据库中鉴定HD-Zip转录因子,并对其进行生物信息学分析。对鉴定到的转录因子的基本理化性质、染色体定位、系统进化、保守基序和基因结构进行分析。共鉴定到45个辣椒HD-Zip转录因子;该家族成员均含有高度保守的HD-Zip结构域;45个HD-Zip基因以不均匀的方式分布在12条染色体上。根据拟南芥HD-Zip家族分类关系,在结合辣椒HD-Zip基因结构的特点分为GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ和GroupⅣ。辣椒HD-Zip转录因子在同一亚族中含有相同的保守基序和基因结构。本研究初步明确了辣椒HD-Zip转录因子家族成员进化关系和结构特点,为进一步研究辣椒HD-Zip转录因子家族的系统发育以及生物学功能提供了依据,为辣椒的分子育种提供科学依据。     

辣椒转录因子CaNAC23基因的克隆与表达分析

为分析NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫中的功能,本研究以‘晋尖椒22’为试验材料,克隆获得CaNAC23基因全长,该基因全长1 899 bp,编码632个氨基酸,预测分子量约为72.54 kD,等电点为6.26,无序化区域有7个。二级结构预测和亚细胞定位预测表明CaNAC23含有一个保守的NAC结构域,定位于细胞核。氨基酸序列比对和进化树分析表明CaNAC23和拟南芥AT3G03200 (NAC045)同源性较高,进化上在同一分支。CaNAC23基因的组织表达特异性和非生物胁迫下的表达模式结果表明:CaNAC23在叶片中表达量最高,其次是根,暗示CaNAC23基因可能参与辣椒叶片或根发育相关。CaNAC23能够被干旱和盐胁迫诱导表达,推测其参与调控辣椒的非生物胁迫调控。本研究结果为研究NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫应答中的功能提供了参考依据。     

基于转录组金银花WRKY转录因子的挖掘与分析

WRKY转录因子是植物抗逆应答过程中最为常见的蛋白家族。为了挖掘金银花抗寒相关的WRKY基因,本研究基于已有的转录组数据,利用植物转录因子数据库和BioEdit对WRKY进行筛选及保守结构域分析,对筛选出的WRKY转录因子利用ExPASy进行理化性质分析,利用PSORT进行亚细胞定位预测,NetPhos进行磷酸化位点分析并且利用MEME数据库对WRKY基因的氨基酸进行序列分析,运用MEGA软件对筛选的金银花WRKY转录因子基因和21个已知抗寒的WRKY基因进行序列同源比对,并构建系统进化树。结果表明:金银花中筛选的30个WRKY基因的蛋白为85～721个氨基酸,理论等电点的范围为4.85到9.76。所有LjWRKY基因编码的蛋白中只有LjWRKY6为稳定蛋白,其余均属于不稳定蛋白,所有蛋白均属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果,LjWRKY所有蛋白定位于细胞核。除LjWRKY23不具有Try磷酸化位点,其它所有氨基酸均具有Ser、Thr和Try磷酸化位点。LjWRKY蛋白比较保守,WRKYGQK没有发生任何变异,且包含三类WRKY转录因子。系统进化树发现,有12个WRKY基因与已知抗寒基因有同源性,推测其参与了金银花低温逆境下的反应。研究结果可以通过筛选的WRKY基因,进行进一步的转基因验证,进而为植物抗寒分子育种提供分子基础。     

蒙古沙冬青AmNAC1和AmNAC2的表达分析与植物表达载体构建

NAC转录因子为植物所特有,是植物抗逆信号转导途径的关键组分,可通过激活许多抗逆功能基因的表达而使植物形成抗逆保护机制。本研究利用RT-qPCR方法分析了强抗逆植物蒙古沙冬青AmNAC1和AmNAC2基因在低温和脱水胁迫下的表达变化。结果表明其表达均受这两种胁迫的诱导而显著上调。同时利用PCR方法克隆到这两个基因的编码区cDNA和gDNA。其gDNA中均含有两个内含子序列。推测AmNAC1和AmNAC2的编码蛋白分别由351个和292个氨基酸残基组成,其氨基酸序列中均含有一个保守的NAC结构域。此外成功构建了两个基因的植物超表达载体。这些工作为进一步鉴定AmNAC1和AmNAC2的功能提供了参考依据。     

巴西橡胶树NAC转录因子HbNAC1基因的克隆及生物信息学分析

为了研究植物特有的NAC(NAM,ATAF1/2和CUC2)转录因子在巴西橡胶树生长发育、胁迫应答和激素调节中的功能,对巴西橡胶树NAC转录因子进行了克隆和分析。根据橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,利用RACE-PCR技术克隆了橡胶树HbNAC1的cDNA序列。生物信息学分析显示HbNAC1基因开放阅读框(ORF)为891 bp,编码了一个296个氨基酸组成的中性不稳定水溶性蛋白,该蛋白的N-端具有保守的NAC结构域,C-端高度变异,具备了NAC转录因子的基本特征。HbNAC1定位在细胞核中,具有3个糖基化位点和21个磷酸化位点,三级结构由3个α-螺旋和9个β-折叠组成。序列比对和系统进化分析显示HbNAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族,推测其可能作为一种氨基酸合成相关的调节酶参与调控植物的免疫反应。     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

基于油橄榄全基因组参与水胁迫NAC基因的鉴定及表达分析

本研究以干旱和水淹胁迫中的‘佛奥’和‘TYZ-1号’2个油橄榄品种苗木为试材,基于油橄榄全基因组数据,鉴定出36个油橄榄NAC转录因子家族成员,利用生物信息学软件进行结构及功能预测,将油橄榄OeNAC蛋白与模式植物拟南芥AtNAC蛋白构建进化树。结果表明OeNAC转录因子分为两个大类和14个亚家族,14个亚家族中有13个亚族同时包含了油橄榄和拟南芥NAC蛋白,说明拟南芥和油橄榄的NAC家族在进化水平上有一定的相似性。结合油橄榄水分胁迫(干旱,水淹)基因表达谱,分析出8个NAC转录因子(OeNAC31, OeNAC33, Oe NAC25, Oe NAC30, OeNAC7, OeNAC23, OeNAC20, OeNAC1)在‘佛奥’和‘TYZ-1号’中均呈现高表达且对水分胁迫均有响应,推测这8个基因是油橄榄水分调节的主要基因。将在水分胁迫下具有表达量的Oe NAC蛋白与已知水分胁迫相关的NAC转录因子构建进化树发现8个胁迫相关的转录因子中的Oe NAC31与已知的水分调控因子支持率更高,表明OeNAC31转录因子可能是参与油橄榄水分调控的最主要基因,其在两个品种中都有不同的表达量,这...     

番茄SlNAC71基因克隆及表达分析

NAC转录因子在植物逆境应答中具有重要的作用。本研究从番茄中克隆了一个NAC基因Sl NAC71。该基因编码区长1 059 bp,编码352个氨基酸,预测分子量约为39.51 k D,等电点为8.40。推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的NAM结构域。Sl NAC71基因序列具有mi R164靶序列识别位点。亚细胞定位预测Sl NAC71蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,Sl NAC71和At NAC分为一个分支。组织特异性表达模式分析表明在检测的所有组织中Sl NAC71都有表达,在叶中表达量最高,在茎中表达量最低。Sl NAC71基因的表达受高盐诱导,说明番茄Sl NAC71基因可能参与番茄对高盐胁迫的应答。     

恶疫霉实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择

为选择合适的内参基因用于分析植物病原卵菌恶疫霉(Phytophthora cactorum)的基因表达情况,本研究利用实时定量RT-PCR分析持家基因Ubc、Tub-b、WS21和WS41在恶疫霉生长发育阶段和侵染草莓阶段的表达差异,并利用软件geNorm、NormFinder和BestKeeper比较其表达稳定性。结果表明：基于公共数据库序列和其他疫霉菌同源序列设计的持家基因引物在恶疫霉中具有良好的扩增效率、反应有效性和特异性。通过分析,发现在恶疫霉的不同生长发育阶段（菌丝生长、游动孢子囊、游动孢子和休止孢萌发）和侵染草莓阶段（接种后3、5、7天）,表现最为稳定的是Ubc基因。当使用多个内参基因时,Ubc和WS41是最适合校正恶疫霉基因表达数据的内参基因组合。本研究结果为利用实时定量RT-PCR准确分析恶疫霉基因相对表达量提供了重要的内参基因,也为其他疫霉菌的基因表达研究提供了有价值的参考。     

番茄NAC基因家族的系统进化及表达分析

本研究挖掘番茄(Solanum lycopersicum)中NAC转录因子家族成员104个,为研究番茄NAC转录因子在响应生物及非生物胁迫中的调控作用提供理论基础,也为番茄NAC转录因子的全基因组分析提供了依据。通过SOL数据库下载番茄NAC、NAM基因及蛋白序列,根据NAC保守域序列号PF01849、PF02365,利用HMMER 3.0软件鉴定番茄NAC基因。再利用保守结构域预测软件Pfam和SMART对候选序列进行筛选鉴定。使用DNAMAN5.0、Web Logo、MEGA5.2、GSDS2.0、Map Inspect、Ex Pasy和Swiss-Model等软件对获选番茄NAC转录因子进行生物信息学分析。通过RT-PCR技术检测番茄NAC转录因子在不同组织中的表达情况。本实验通过生物信息学方法对番茄中NAC基因家族成员进行了预测及分析。预测及分析结果显示,番茄NAC基因家族包含104个蛋白质,通过分组鉴定和进化树分析将番茄NAC基因家族分为12个亚族,番茄特有的TNAC亚族成员最多为28个。本实验对挖掘到的104个NAC转录因子的分子量、等电点、保守结构域及蛋白质二、三级结构进行了预测及分析。本实验选取12个NAC转录因子家族成员进行RT-PCR技术检测,获得其在根、茎、叶、花、果中的表达情况,半定量结果显示,7个Sl NAC基因在根、茎、叶、花、果(红熟)中均有表达,并呈现出多种表达模式。番茄NAC转录因子家族在结构上高度保守,并参与番茄生长发育、生物及非生物胁迫的调控过程。     

辣椒疫霉菌果胶裂解酶PL101基因真核表达及致病性分析

辣椒疫霉菌(Photophthora capsici)常引起辣椒等多种作物的毁灭性病害,对该病原菌重要功能基因尤其是致病基因的研究具有重要的经济学意义.果胶裂解酶(pectate lyase,PL)为植物病原菌关键致病因子,通过降解寄主细胞壁引起寄主发病.本研究以辣椒疫霉菌PL关键成员(PL101)为材料,通过真核表达系统进行诱导表达重组蛋白.真核表达载体选用pPIC9K,测序验证后的重组质粒pPIC9K/PL101经电击法转化毕赤酵母GS115表达菌株,对阳性转化子进行甲醇诱导型(Mut+)、不同浓度抗生素G418即高拷贝转化子筛选获得表达量可观的重组蛋白表达菌株.重组酵母菌经1％甲醇诱导7d获得重组蛋白,经硫酸铵沉淀法、Ni-NTA亲和层析纯化后获得纯度较高的PL101纯蛋白.经聚半乳糖醛酸反应法测得的PL101酶活达到970 U/mg,接种健康辣椒叶片测试结果表明PL101具较高致病性,表明PL101是辣椒疫霉菌重要致病因子.本研究为进一步阐明PL作用机理提供科学依据,进而为辣椒的抗病育种提供基因资源.     

梭梭NAC家族基因转录组鉴定及干旱和盐胁迫下的表达分析

NAC转录因子在超旱生C4植物梭梭中的成员数量、序列结构特征及调控形态建成和应答生物、非生物胁迫等过程的分子机理亟待明确。本研究以模式植物NAC基因为种子序列,在已有的梭梭转录组测序数据中比对并发掘可能编码NAC的转录本,利用生物信息学方法预测梭梭NAC家族成员基因结构、保守结构域、亚细胞定位等信息,分析梭梭和模式植物NAC基因家族的进化关系。采用实时荧光定量PCR技术检测Ha NACs在模拟干旱及盐胁迫下的表达规律。本研究共鉴定得到49个梭梭NAC家族成员;21个编码150个以上氨基酸的unigene中17个具有NAM结构域,预测等电点在4.51~9.47之间,15个Ha NACs蛋白预测定位在细胞核中,N端序列中包含与模式植物类似的5个亚结构域和核定位信号序列;NAM/CUC3、SENU5、TIP、NAP、ATAF和TERN组均包含与之进化关系较近的Ha NACs。干旱和盐胁迫处理下,21个Ha NACs的表达模式具有多样性,表达量间具有显著差异性,暗示着它们可能与盐和干旱胁迫应答过程相关。研究结果表明,梭梭NAC家族基因的序列结构具有较高的保守性,家族成员在应答、调节干旱和盐胁迫等方面表现出多样性。本研究为解析梭梭NAC基因的功能提供了基础数据。     

芒SWN1基因的同源克隆及生物信息学分析

植物次生壁生物合成的转录调控网络是由一系列次生壁NAC开关转录因子介导的。在该网络中,顶层主开关SWNs (secondary wall NACs)转录因子与二级主开关MYBs转录因子共同激活下游转录因子和次生壁生物合成基因的表达,并且在进化上具有保守性。为探究芒次生壁合成调控网络,本研究利用水稻次生壁合成调控基因OsSWN1 (SECONDARYWALL NAC DOMAINPROTEIN 1 from Oryza sativa)通过同源克隆法扩增得到了芒MsSWN1基因的cDNA序列。序列分析显示MsSWN1基因编码区长1 215 bp,编码404个氨基酸。所编码的蛋白质相对分子量为43 181.39 kD,预测其等电点(pI)为6.57,属于亲水蛋白,具有保守的NAC结构域。通过二级结构和三级结构预测分析表明,α-螺旋及不规则卷曲是其蛋白质结构中的主要结构组成元件。序列分析和系统进化树分析显示,芒MsSWN1基因编码的蛋白与甘蔗和高粱亲缘关系最为接近,并且该基因在其他禾本科植物中也具有很高的保守性,推测芒MsSWN1基因可能也具有调控次生壁生物合成的功能。本研究旨在为进一步挖掘和验证芒MsSWN1基因功能提供依据,为未来构建芒次生壁合成调控网络和更高效生产生物燃料提供有益信息。     

三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析

为了揭示三七抗病防卫反应的调控机制,对三七的一个NAC转录因子的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。以一年生三七幼苗为材料,根据编码NAC转录因子的三七转录组Unigene设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的NAC转录因子基因,命名为PnNAC1。序列分析表明,该基因全长815 bp,含有24 bp的5'非翻译区和215 bp的3'非翻译区,以及576 bp开放阅读框,共编码191个氨基酸,具有保守的NAC结构域。实时荧光定量PCR结果显示茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的转录水平,接种茄腐镰刀菌后,PnNAC1的表达进一步上升,在接种后4 h转录水平达最大值;无菌水预处理的三七中,PnNAC1也快速响应茄腐镰刀菌的侵染,但表达水平明显低于茉莉酸甲酯预处理的样品。接种人参链格孢后PnNAC1在叶片的表达量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和过氧化氢4种信号分子处理三七根部均诱导PnNAC1的表达。表明PnNAC1响应几种逆境相关信号分子,并参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。     

甜菜NAC转录因子BvNAC46基因的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的强抗旱甜菜品种HI0466为材料,通过RT-PCR技术克隆到一个甜菜NAC类转录因子基因的cDNA序列,命名为BvNAC46(GenBank登录号:XM_010689163.2)。序列分析表明,该基因序列全长1 047 bp,包含一个576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸,为稳定的疏水性蛋白,推测理论分子量为88.725 kD,亚细胞定位于细胞核中。含有一个NAM保守结构域,具有NAC转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了甜菜BvNAC46基因的植物表达载体pCAMBIA2301-BvNAC,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能提供参考。     

芒果转录因子NAC的克隆与表达模式分析

NAC转录因子在植物生长发育、信号传导和逆境胁迫应答方面起重要的作用。本研究根据芒果c DNA-SCo T差异显示中发现的c DNA片段设计特异引物,通过改良RACE技术得到了芒果NAC基因的全长c DNA序列。序列分析显示,该c DNA全长为1 167 bp,开放阅读框长度为1 002 bp,编码334个氨基酸,推测其分子量为37.41 k D,等电点为8.76,属于NAM基因家族,命名为Mi NAC。利用实时荧光定量技术对Mi NAC基因在芒果4℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000胁迫后0、24 h、48 h和72 h时叶片和茎中表达模式进行分析,实验结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果Mi NAC基因的表达,其中Mi NAC基因对4℃低温胁迫响应程度最高,其次是PEG胁迫和盐胁迫。结果表明,该基因参与了芒果逆境胁迫的分子调控。     

花生NAC转录因子AhNAC2和AhNAC3的克隆及转录特征

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子。本实验从花生中克隆了2个NAC基因AhNAC2和AhNAC3(GenBank登录号EU755023和EU755022);蛋白序列分析表明,两者具有典型NAC转录因子特征,N端含有保守NAC结构域。半定量RT-PCR显示,在ABA和GA₃处理,以及控水和低温条件下,AhNAC2和AhNAC3在花生组织中的表达上调,呈现不同的表达模式。AhNAC2和AhNAC3为典型的NAC转录因子新基因,蛋白序列与拟南芥RD26同源性较高,推测与响应干旱和ABA信号有关。