马尾松PmLFY和PmNLY基因的克隆与表达分析

本研究在前期马尾松转录组测序中获得两个LFY同源基因片段的基础上,克隆获得Pm LFY和Pm NLY基因全长,分别为1 164和1 212 bp,编码387和403个氨基酸。生物信息学分析表明,2个LFY同源基因都具有典型的FLO_LFY结构域,但Pm NLY基因缺失了XEL…XTL…XEL…拉链结构。同源性和进化分析表明,LFY和NLY基因分别单独分为一类,并且与针叶植物的亲缘关系非常近。表达分析表明,2个基因都为组成型表达,均主要参与了雌球花发育过程,并且Pm LFY还参与了球果发育。本研究为今后马尾松花发育机理研究提供理论依据。     

胡桃楸成花相关LFY同源基因的克隆和序列分析

通过对胡桃楸成花相关LFY基因进行研究,对缩短胡桃楸童期,促进其提早开花结实有着极为重要的意义。采取PCR扩增技术,在NCBI数据库中进行搜索,查找到与目的基因有关联的同源序列;并根据这些有关联的序列来进行引物设计,扩增目的基因全长。克隆LFY基因cDNA序列全长为1 297 bp,其中CDS序列长1 158 bp,编码385个氨基酸。NCBI数据库Blast比对表明胡桃楸LFY同源基因与其他物种的LFY同源基因同源性均在80%以上。将胡桃楸LFY同源基因命名为JmLFY(GenBank登录号:KX364241)。通过BioEdit软件和ProtParam ExPASy在线软件分析胡桃楸JmLFY蛋白质分子式为C_(1878)H_(2962)N_(566)O_(578)S_(13),分子量为43 134.4 Da;理论等电点pI值为6.78;不稳定指数为39.92,属于不稳定蛋白质。该研究为进一步探索LFY基因对胡桃楸成花的影响提供依据。     

玉米类LFY基因的克隆及其在不同光周期条件下的表达

采用每天9 h和15 h两种光照条件对热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早四进行处理。以玉米茎尖为材料，采用RT-PCR方法，分离到1个1 265 bp的全长cDNA克隆，序列比较表明其为拟南芥LFY基因的同源基因，命名为类LFY（基因登录号为DQ343237）。类LFY与同源基因zfl2、RFL、LFY和FLO的同源性依次为93%、84%、57%和57%。它的DNA序列和推论的蛋白质序列与zfl1同源性最高，其编码的蛋白质与zfl1相比在第28、29和160位分别少1个丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸，在188位置多1个甲硫氨酸。该基因在2个供试自交系茎尖中长日照条件下不同生长时期持续表达，短日照条件下生长早期和后期不表达，其功能有待进一步研究。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

马尾松FLO/LFY基因的克隆及其功能分析

FLO/LFY及其同源基因是控制花分生组织形成和开花时间的基因之一。本研究通过反转录PCR克隆技术和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从马尾松中分离得到了PmLFY和PmNLY两条FLO/LFY基因的cDNA序列。两条序列均包含完整的编码区与"5'端"和3'非翻译区,长度分别为1 555 bp和1 236 bp,对应的编码氨基酸长度是411 aa和310 aa。序列分析发现PmLFY和PmNLY两个蛋白均属FLO/LFY蛋白;分别有13和11个丝氨酸激酶位点。对PmLFY和PmNLY两个蛋白与其他物种的FLO/LFY蛋白构建进化树,发现PmLFY蛋白与辐射松最为接近,与加勒比松、挪威云杉等较为接近,属同一分支;PmNLY蛋白只存在于裸子植物之间,与辐射松,华山松等松科关系较近,但与PmLFY分化较明显;裸子植物之间LFY-like与NLY-like分化十分明显,裸子植物的NLY蛋白与被子植物的FLO/LFY更为接近。通过组织特异性分析发现,PmLFY和PmNLY主要集中在冬芽中表达,且在侧芽的表达量高于顶芽,分别相对于顶芽表达量的1.8和1.3倍。研究结果为进一步分析马尾松FLO/LFY的功能和开花作用机制奠定了基础。     

OsI2基因的克隆及其植物表达载体的构建

在旱稻IRAT109干旱胁迫下cDNA芯片分析结果的基础上,通过RT-PCR,5'-RACE及3'-RACE方法,从IRAT109总RNA中扩增得到了干旱胁迫下芯片表达谱中上升表达强度第二的基因全长序列,命名为OsI2,全长有523 bp,并对基因序列结构进行了分析.该基因与全长cDNA文库中的CT836140.1有99%同源.OsI2基因编码产物对应1个包含57个氨基酸的开放阅读框(ORF),为一功能未知蛋白.其编码产物也可能对应两个中间相隔19 bp的较小ORFs(43个氨基酸和42个氨基酸),都是功能未知的蛋白.在pBI121载体的基础上,将OsI2基因与CaMV35S连接成功构建了pBl121-OsI2植物表达载体,为进一步研究其功能创造了条件.     

菠萝LEAFY基因克隆与表达模式研究

植物LEAFY(LFY)基因可以调控花分生组织和花器官的形成。根据菠萝基因组数据库信息,本研究从菠萝(Ananas comosus(Linn.)Merr.)顶芽中成功克隆了菠萝LFY基因c DNA全长序列。分析结果表明,Ac LFY编码366个氨基酸,含有5'-N端脯氨酸富集区、亮氨酸重复区以及碱性及酸性结构域,具有FLO/LEAFY家族的典型结构特征。利用实时荧光定量PCR技术分析了Ac LFY基因在菠萝自然成花和乙炔处理成花不同发育阶段的表达情况。结果显示,乙炔处理可以诱导Ac LFY基因表达,处理后40 d即菠萝花序形成时期表达量最高,随后逐渐下降;自然成花过程中,Ac LFY基因的表达在50 d时达到最高峰,此时为花原基发育、花序形成时期。Ac LFY基因在不组织器官中的表达存在明显差异,顶芽中表达量最高,根系中表达量最低。     

毛果杨PtATAF1-1转录因子基因的克隆及功能分析

ATAF1蛋白是NAC转录因子家族的成员,在植物发育过程以及胁迫应答中有着重要的调控作用。在本研究中,利用cDNA末端的快速扩增技术,从毛果杨中克隆了一个ATAF1同源基因的全长cDNA,并将相应的基因命名为PtATAF1-1。生物信息学分析表明,Pt ATAF1-1全长cDNA序列为1 242 bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码区长873 bp。氨基酸序列多重比对分析表明,PtATAF1-1蛋白质中具有NAC家族保守的NAM结构域;杨树原生质体瞬时表达Pt ATAF1-1显示其定位在细胞核中。此外,在细菌鞭毛蛋白N端保守区域(Flg22)和脱落酸(ABA)处理下,PtATAF1-1基因的表达水平诱导发生变化。本研究对PtATAF1-1基因的同源克隆与功能分析,为深入开展ATAF1基因在杨树中的功能提供了参考依据。     

津田芜菁BrSIZ1基因克隆、定位及表达

SIZ1是植物细胞蛋白质翻译后修饰SUMO化的E3连接酶,参与植物蛋白相互作用、定位和抗逆反应等。为研究BrSIZ1在津田芜菁中的表达特性,本研究克隆了津田芜菁SIZ1基因全长cDNA序列,命名为BrSIZ1 (GenBank登录号为KY441465),该基因全长2754 bp,其ORF全长2571 bp,编码856个氨基酸残基的多肽。构建了BrSIZ1-GFP表达载体进行亚细胞定位研究,结果显示BrSIZ1-GFP定位于细胞核内,可能在细胞核中发挥其功能。利用荧光定量PCR检测表明,该基因表达量在叶子中最高,幼苗和红色根皮中次之,表达具有组织特异性。而且BrSIZ1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导,在4°C、37°C胁迫的幼苗中,表达量增加。     

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因.该基因cDNA全长1328 bp,包括1008bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35911.03Da,极性氨基酸占29.12%.序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远.     

夜来香LIS基因的克隆与表达分析

为了研究夜来香生物钟和花香代谢机制,本研究以夜来香花瓣为材料,利用PCR技术,从中获得了夜来香LIS基因的全长cDNA,并命名为CnLIS。生物信息学分析结果表明:该cDNA序列全长为1 800 bp,编码560个氨基酸,其中ORF为1 683 bp,5'UTR为56 bp,3'UTR为61 bp;该序列编码的氨基酸序列与软枣猕猴桃、温州蜜柑LIS基因的同源性分别为55%、50%,属于类异戊二烯合成C1超级家族。实时荧光定量PCR分析结果表明,0~12 h CnLIS表达水平较低,16 h后表达量明显上调,20 h表达量达最大,随后表达量急剧下降,其表达量随花瓣开放与闭合呈节律性变化。推测CnLIS可能参与夜来香香气形成,调控花香形成过程,同时,该基因的表达可能受生物钟基因所调控。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

荔枝SUMO结合酶基因LcSCE1的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从荔枝胚性愈伤组织中克隆得到了SUMO结合酶1基因的全长cDNA序列,命名为LcSCE1。LcSCE1 cDNA全长为840 bp,CDS全长483 bp,预测可编码160个氨基酸。生物信息学分析发现:LcSCE1为带负电的亲水不稳定蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,进化上,LcSCE1与麻风树SCE1蛋白亲缘关系最近。利用Real-time PCR技术研究了LcSCE1在不同组织部位的表达情况,发现该基因在"元红"荔枝各组织器官中均有表达,在新叶与芽中表达量最高,膨大期果核中该基因的表达量也显著高于成熟果核(p0.01)。此外,本研究还比较了该基因在醮核和正常核中LcSCE1的表达情况,发现它在醮核中的表达量显著高于正常核(p0.01)。本研究结果表明LcSCE1可能在荔枝生长发育及醮核产生过程中发挥着重要作用。     

油用牡丹PsFAD6基因的克隆与表达分析

本研究以油用牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR的方法克隆得到油用牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(ω-6 FAD)基因cDNA全长,命名为PsFAD6(GenBank登录号:KY233120)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 819 bp,其中开放阅读框1 326 bp,编码441个氨基酸,3'端非编码区长271 bp,5'末端非编码区长192 bp;多序列比对表明,油用牡丹PsFAD6氨基酸序列含有3个保守结构域,系统发育分析显示油用牡丹与葡萄处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PsFAD6蛋白无信号肽,具有3个跨膜域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性分析表明,PsFAD6在油用牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶片中表达量最高,雄蕊次之,在雌蕊中表达量最低;不同发育时期种子中,80 d表达量最高,60 d次之,在20 d中表达量最低     

谷子DnaJ蛋白基因的克隆

DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。     

马尾松PmMADS13基因的克隆与表达分析

SOC1/TM3是MADS-box家族一员,它能介导多条开花途径的信号整合,从而调控开花的时间和花器官的发育。为了解SOC1类基因在马尾松生殖生长中的作用,从转录组测序结果中筛选到一条SOC1类同源基因,设计特异性引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得该基因的全长cDNA序列为1 147 bp,包括666 bp的开放阅读框(ORF),共编码220个氨基酸,命名为PmMADS13。氨基酸序列比对分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端具有高度保守的SOC1 motif基序;进化树分析表明马尾松PmMADS13与油松的DAL9基因、辐射松的MADS9基因、火炬松的MADS13基因的亲缘关系最近,属于SOC1/TM3亚家族;RT-PCR分析显示,PmMADS13在马尾松生殖器官雌花、雄花中均有高表达,其次是茎端和针叶,在根部组织中的表达量最低。推测PmMADS13是参与马尾松成花的重要基因。     

山茶C功能基因CjPLE的克隆及在重瓣品种中的表达模式分析

经典ABC模型中的C功能基因是决定花内轮雄蕊和雌蕊器官的重要因子,也是花分生组织终止分化的调控基因。以野生"红山茶"(Camellia japonica)为材料,克隆了C功能基因CjPLE(MF278983),其c DNA全长为901 bp,开放阅读框780 bp;染色体步移实验表明其基因结构中含有两个内含子;系统进化树分析发现它与番茄TAG1和金鱼草PLE等基因组成PLE亚类。荧光定量PCR的结果显示,该基因在野生"红山茶"的心皮中有很高的表达量;在牡丹型重瓣的品种"红露珍"和"状元红"中,雄蕊中的表达量最高,而在"绒球"的内轮花瓣和雄蕊中都有较高的表达量。以上结果表明Cj PLE是山茶属C功能基因PLE分支点同源基因,并可能在调控重瓣花的花器官属性决定形成中发挥作用。     

火把梨14-3-3基因的克隆与序列分析

依据火把梨(Pyrus pyrifolia Nakai)14-3-3蛋白的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE),从云南火把梨中克隆一个新的14-3-3基因(Pp14-3-3)的全长cDNA序列。Pp14-3-3全长cDNA为1 107 bp,具有84 bp 5’非编码区(Untranslated Regions,UTR)、786 bp开放读码框(Openreading frame,ORF),以及237 bp 3’UTR,编码含261个氨基酸的蛋白质。Pp14-3-3与其他物种14-3-3蛋白在中间功能区域高度保守,包含典型的14-3-3结构域。与已知植物14-3-3s家族成员间的氨基酸序列进行聚类分析,将Pp14-3-3聚为非ε大类14-3-3。Pp14-3-3在火把梨接受光照和没有光照的果皮以及幼嫩叶片中大量表达,且表达量稳定。对Pp14-3-3的基因克隆以及表达特性进行了分析,为后期深入研究该新基因的功能奠定了基础。     

兰州鲇Dmrta1基因克隆及其组织时空表达规律

为了解Dmrta1基因的生物学特性及其在兰州鲇生长发育中的生理作用，以及为加快实现全雄兰州鲇群体生产提供理论依据和技术支撑。采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得兰州鲇Dmrta1全长cDNA序列，通过qRT-PCR技术检测该基因在兰州鲇胚胎发育、仔稚幼鱼以及3龄雌雄异体和3龄雌雄同体不同组织中的表达特征。结果表明，兰州鲇Dmrta1基因cDNA全长1 415 bp, ORF全长1 158 bp,共编码385个氨基酸，包含20种氨基酸；经SMART预测显示，该基因属于典型的Dmrta亚家族蛋白，具有保守的DM和DMA结构域。同源性比对和系统进化树分析结果表明，兰州鲇与南方鲇的相似性最高(95.47%),且亲缘关系最近。组织表达结果表明，Dmrta1 mRNA在未受精卵粒及胚胎发育各个时期均有表达，而在未受精卵粒中表达最高(P<0.05);在兰州鲇孵化后40 d内不同发育时期中，Dmrta1 mRNA在同期XX个体组织中表达均显著高于XY个体，且在35 d迅速达到峰值(P<0.05);Dmrta1 mRNA在3龄雌雄异体兰州鲇雌性卵巢、鳃和雄性鳃组织中表达显著...     

棉花多胺氧化酶基因(GhPAO_2)的克隆及非生物胁迫下的表达分析

本研究以拟南芥多氨氧化酶(AtPAO2)为探针,在雷蒙德氏棉基因组数据库中获得同源基因并设计引物,利用RT-PCR技术克隆PAO基因,分离一个新的陆地棉PAO基因命名为GhPAO2。该基因cDNA全长为2 237 bp,具有一个1473 bp的开放阅读框,编码490个氨基酸残基,预测该基因蛋白质分子量为54.41 kD,等电点为5.69。利用Real-time PCR对该基因在不同组织和多种非生物胁迫处理进行表达分析,结果表明:GhPAO2基因主要在棉花花瓣和叶中表达;不同胁迫处理下GhPAO2基因表达量均发生显著变化,其中低温处理和20%PEG处理后基因表达量迅速上升并在1 h时表达量达到最高,200 mmol/L NaCl和1 mmol/L ABA处理则在24 h时表达量达到最高,表明GhPAO2基因受低温、PEG、Na Cl和ABA诱导表达,可能在棉花抵御非生物胁迫过程中发挥重要作用。