红芽芋低温疗法脱毒苗遗传变异的AFLP检测

为探明红芽芋低温疗法脱毒苗的遗传变异,本研究利用AFLP荧光标记和毛细管电泳分离技术对其进行分析。研究表明,利用10对引物组合对江西铅山红芽芋4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本进行扩增,扩增后的多态性位点数在49~70范围之内。多态性百分率最低是E36M72,为89.23%,多态性百分率最高是E59M66,为100%;观测等位基因数Na在1.892 3~2.000 0的范围之内,有效等位基因数Ne在1.616 6~1.908 2的范围之内;Nie's基因多样度H的范围为0.357 4~0.473 8,Shannon信息指数I的范围为0.526 8~0.666 2;依据其荧光AFLP扩增结果进行编码组合,构建了江西铅山红芽芋AFLP组合编码指纹图谱。4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本均出现了AFLP变异位点,每个样本变异位点平均出现的数量为8.73~23.30;4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本的遗传相似系数为0.471 8~0.796 2,样本间的相似度不是很高,低温疗法脱毒存在一定程度上的变异。在遗传相似系数0.605 1处,4种低温疗法脱毒苗和大田苗30个样本被分为4大类。第Ⅰ类包括样本1和样本30,第Ⅱ类包括样本27和样本29,第Ⅲ类包括样本26和样本28,剩下的样本均归于第Ⅳ类。表明低温疗法脱毒造成了江西铅山红芽芋一定程度的遗传变异。本试验结果为江西铅山红芽芋茎尖低温疗法脱毒提供一定的理论依据。     

超低温疗法在草莓病毒脱除中的应用

超低温疗法是近年发展起来的一种新型高效的脱毒技术,其脱毒率显著高于传统的脱毒方法。本研究以感染草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒、草莓镶脉病毒和草莓轻型黄边病毒的红颜草莓茎尖为试材,对超低温疗法中茎尖长度以及关键程序(预培养和预处理)进行筛选和优化,以期建立起完善的草莓超低温疗法脱毒技术体系。研究结果表明,在病毒脱除过程中,茎尖长度对脱毒率没有影响,然而却显著影响成活率。优化的超低温保存体系为:预培养蔗糖浓度为0.3 mol/L,暗培养7 d;室温60%PVS2装载60 min;0℃100%PVS2玻璃化处理60 min;液氮处理1d后,于38℃~40℃水浴2 min。在此体系下,草莓的茎尖存活率为68.89%,但草莓皱缩病毒、草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒和草莓轻型黄边病毒被同时去除,脱除率为100%,上述研究结果将为草莓脱毒苗的培育提供重要参考。     

江西铅山红芽芋芋病毒种类lncRNA测序鉴定及其序列分析

探究江西铅山红芽芋的主要病毒种类及其序列信息，为其脱毒苗培育提供依据。采用lncRNA测序技术确定江西铅山红芽芋的病毒种类，并利用RT-PCR技术、生物信息学分析软件和qRT-PCR技术进行病毒验证、序列分析和组织表达分析。江西铅山红芽芋检测到芋花叶病毒（DsMV）和花椰菜花叶病毒（CaMV）两种病毒；DsMV和CaMV基因cDNA总长度分别为1780 bp和5412 bp，分别编码592和1803个氨基酸；DsMV和CaMV多聚蛋白二级结构均由α螺旋、β-片层、无规则卷曲构成，其三级结构均为单体蛋白；DsMV和CaMV在江西铅山红芽芋根、茎、叶中均有侵染，但均在叶中表达量最高。明确了侵染江西铅山红芽芋的主要病毒种类，并首次在江西铅山红芽芋上检测到CaMV。     

江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗遗传稳定性的SSR检测

为了检测江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗是否存在遗传变异,本研究采用SSR分子标记技术与毛细管电泳技术相结合的方法来检测江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗的遗传稳定性。结果表明,根据PAGE检测从38对引物中选出10对引物(P10,P11,P18,P23,P24,XP3,XP5,XP7,XP8,XP10);10对引物的30个样本(包括低温疗法脱毒苗和大田苗)分型基本相同,且其多样性指数较低,观测纯合度和期望纯合度也均高于观测杂合度和期望杂合度;30个样本的遗传距离大部分均为0,少量为0.032 3、0.033 9或0.198 6,遗传相似系数大部分均为1,少量为0.968 2,表明遗传分化程度极低;按照UPGMA法进行聚类分析,30个样本聚为一类。以上研究表明,江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗无遗传变异,低温疗法脱毒可保证其遗传稳定性。本研究可为江西铅山红芽芋低温疗法脱毒提供遗传稳定性方面的依据。     

“水城小黄姜”芽茎尖组培脱毒与快繁体系的建立

为建立“水城小黄姜”芽茎尖组培脱毒快繁体系，本试验以“水城小黄姜”芽茎尖为外植体，研究不同消毒时间、不同诱导分化培养基、不同增殖培养基及不同生根培养基对茎尖消毒、愈伤组织诱导、不定芽增殖、生根的影响，并对组培苗进行脱毒效果的检测。结果表明：“水城小黄姜”芽茎尖采用75%医用酒精消毒60 s+10%次氯酸钠(NaClO)消毒20 min处理效果最好，污染率7.7%，成活率达87.2%；不同培养基配比对茎尖诱导分化效果有差异，以MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L效果最佳，愈伤诱导率达75.0%；最适增殖培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，增殖系数大，长势旺盛、茎粗芽壮、叶绿，组培苗生长好，且可与生根协同接续；适宜生根的培养基为MS+NAA 0.10 mg/L，生根数多，平均根长适中。用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定组培苗中烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)，获得了“水城小黄姜”脱毒核心苗，且脱毒率达93.75%。因此，本研究认为通过“水城小黄姜”芽茎尖脱毒组培快繁体系的建立，可为“水城小黄姜”种苗的脱毒快繁及工厂化...     

芋组培脱病毒技术及其增产效益的研究

试验研究了莱阳孤芋茎尖培养脱毒技术及脱毒芋的产量表现。结果表明，茎尖大小在0.3-0.5mm时，成活率在80%以上，适宜茎尖分化的培养基为MS＋BA1.0mg/L NAA0.2mg/L Spm20mg/L。3次剥离茎尖培养所得试管苗经酶联免疫检测及电镜观察显示，已不带芋花叶病毒。脱毒试管苗定植后，植株生长旺盛，后代球茎数量达每株31．2个。小区对比试验表明，脱毒原原种芋，原种芋可使球茎数量比对照增加37．0％－52．5％，同时使单位面积产量和商品芋产量分别增加20．2％－43．9％和49．9％－70．0％。     

红芽芋低温疗法脱毒苗遗传稳定性同工酶检测

本研究对江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗的遗传稳定性进行同工酶检测。结果表明,SOD同工酶酶谱共有4条酶带,Rf分别为0.196、0.534、0.589和0.625,Af均为100%;POD同工酶酶谱共有7条酶带,Rf分别为0.018、0.053、0.228、0.263、0.316、0.351和0.632,Af均为100%;CAT同工酶酶谱只有1条酶带,Rf为0.145,Af为100%;SOD、POD和CAT同工酶的多态性百分率(P)均为0,有效等位基因数(Ne)均为1.000;SOD、POD和CAT同工酶酶谱带的遗传相似系数均为1.000,聚类分析显示低温疗法脱毒苗与大田苗均在同一组,表明低温疗法脱毒苗的遗传稳定性高,无遗传变异。本试验结果可为江西铅山红芽芋低温疗法脱毒苗的遗传稳定性提供一些同工酶方面的依据。     

山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定

为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类,从山东诸地11个蔬菜种植区采集了867个葫芦科蔬菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样品分别进行RT-PCR检测,各病毒检出率分别为34.8%,10.4%,20.0%,41.7%,27.0%,7.8%,2.6%,1.7%,0,0.9%。表明除PNRSV外,其他9种病毒在山东各地均有发生,且CMV和TMV发病率较高,2种或2种以上病毒复合侵染也很普遍。同时为明确山东地区CMV分离物的株系分化状况,选取11个地区有代表性的CMV阳性样品,测定其外壳蛋白(Coat protein,CP)和RNA3核苷酸序列并进行序列比对和进化分析,结果显示侵染山东地区葫芦科蔬菜的CMV分离物均属于IB亚组,与韩国分离物As(AF013291)相似性最高,未发现其他株系。     

建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的脱除研究

本研究的主要目的是通过茎尖培养的技术手段来探索蝴蝶兰病毒的脱除问题,为建立工厂化无毒苗培养体系提供技术支撑。长期的工厂化生产,使蝴蝶兰经常感染各种病毒,导致叶片产生枯斑、褪绿、坏死等现象,使花朵畸形变色。其中建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是最常见的2种病毒。实验取已检测出含有CymMV和ORSV病毒的蝴蝶兰植株花梗,进行诱导丛生芽的培养,对丛生芽进行继代增殖形成组培苗用于脱毒处理。切取组培苗的茎尖顶端分生组织进行培养,茎尖长度在1~6 mm之间,随着茎尖长度的增加,成活率上升,脱毒率明显降低。取2~3 mm组培苗茎尖,经0、10、20、30、40 mg/L的三氮唑核苷浸泡15 min处理和在含有相应浓度的三氮唑核苷培养基中培养30天后,继代培养形成再生植株。实验采用ELISA法对脱毒前的蝴蝶兰植株以及脱毒后的再生植株进行2种病毒检测,通过显色反应判断是否含有病毒病原。实验结果表明,蝴蝶兰脱毒苗的成活率随着三氮唑核苷浓度的增加而降低,当其浓度达到40 mg/L时,茎尖顶端分生组织出现严重的透明和褐变现象,未获得再生植株。而试管再生苗的脱毒率则随着三氮唑核苷浓度的升高而增加。在添加30 mg/L的三氮唑核苷进行化学抑制病毒的处理后,可以比单纯使用茎尖培养的方式脱毒率提高22.3%。     

超低温保存法去除马铃薯X病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒

病毒病严重危害马铃薯生产,是造成马铃薯减产和品质下降的主要因素。PVX和PSTVd属于危害马铃薯最主要的病毒。本文尝试用超低温保存法和常规方法(茎尖分生组织培养、温热疗法以及温热疗法结合茎尖分生组织培养)来去除马铃薯试管苗中的PSTVd和PVX。结果显示马铃薯茎尖经过超低温保存后,存活率和成苗率分别为83.64%和72.04%,高于茎尖分生组织培养(46.67%和31.49%)、温热疗法(72.22%和44.44%)以及温热疗法结合茎尖分生组织培养(50.54%和30.38%)。4种方法都可以去除PVX,其中超低温保存法的脱毒率最高,为59.13%,温热疗法结合茎尖分生组织培养为56.02%,温热疗法和茎尖分生组织培养较低,为42.61%和35.83%。但是4种方法都未能有效地去除PSTVd类病毒,只能通过严格检疫来控制。     

郁金香主要病毒的分子检测研究

本研究以新疆郁金香种植区植株和进口种球为材料,利用特异性引物,对侵染郁金香的主要病毒黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的一步法RT-PCR分子检测技术进行了初步研究。根据两种病毒的基因序列,合成了两对特异性引物,并对RT-PCR中的引物浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了筛选和优化。研究显示,阳性对照和带病毒植株均扩增出了与预期大小一致的特异性条带,而健康植株无任何扩增产物。一步RT-PCR的最佳反应体系为:模板RNA 1μL,2×1 Step Buffer 25μL,上、下游扩增引物各1μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2μL,加RNase Free dd H2O至50μL。黄瓜花叶病毒(CMV)和碎色病毒(TBV)特异性引物的最佳反应程序:c DNA合成50℃30 min;预变性94℃2 min,变性94℃30 s,退火(CMV)56℃/(TBV)52℃30 s,然后72℃延伸l min,30个循环,最后72℃延伸10 min。实验表明,种植区内栽培一年的郁金香植株部分已被CMV和TBV侵染,其中还有复合侵染的现象存在。本研究建立了基于核酸水平的高灵敏度的一步RT-PCR法郁金香病毒检测技术,能准确的检测出植株中的TBV和CMV,适用于郁金香黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的鉴定和检测,为脱毒组培苗的检测和脱毒体系的建立提供理论依据和技术支撑。     

香石竹茎尖试管苗继代培养玻璃化现象的研究

香石竹红色品种茎尖试管苗继代培养玻璃化现象是香石竹脱毒试管苗生产的一个主要障碍。采用改善光照,在培养中提高糖和琼脂的浓度,降低细胞分裂素的用量,对克服香石竹茎尖试管苗继代培养玻璃化有明显效果,但对一些红色系品种效果并不理想,继代培养玻璃苗率仍达61%以上。     

银川、徐州和赤峰地区番茄病毒病种类的鉴定

对2021年发生在银川、徐州、赤峰的番茄叶片出现黄绿相间的斑驳、叶片皱缩卷曲、植株矮化等疑似番茄病毒病的症状进行了鉴定。利用12种番茄病毒病的特异性引物进行RT-PCR检测，发现所检测的不同地区样品中，侵染番茄最多的病毒为黄瓜花叶病毒（CMV），检出率为60.00%，其次是番茄斑萎病毒（TSWV），检出率为46.67%。通过核苷酸序列比对发现，检测出的这2种病毒与CMV(AJ131619.1)和TSWV(MK318839.1)同源性最高，相似度分别为97%和99%。同时，基于CMV和TSWV基因序列构建系统发育树表明，宁夏银川地区番茄病毒样本为CMV和TSWV复合侵染。     

掌叶半夏微茎尖培养脱毒和快繁体系的建立

研究了茎尖大小、激素浓度、培养基成分对药用植物掌叶半夏脱毒效果的影响以及影响无病毒苗快速繁殖的因素等,结果表明：茎尖大小是影响茎尖成活和脱毒效果的主要因素,0.2~0.5mm的茎尖培养在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基上,成活率为53.3%,病毒脱除率为76.7%,培养基中附加247mg/L NH₄ ⁺可有效提高茎尖成活率至86.7%,同种培养基上继续培养,可一次性成功诱导形成试管苗,移栽成活率高达100%。MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+GA₃ 0.5mg/L组合最有利于试管茎的形成和发育,从而建立了以掌叶半夏微茎尖为外植体的脱毒和快速繁殖体系。     

红地球葡萄GLRaV-3的茎尖培养脱毒及RT-PCR检测

本文以带GLRaV-3病毒的红地球为试材,研究了6-BA、NAA、IBA、KT不同配组及茎尖大小对茎尖培养的影响,并利用RT-PCR技术对部分红地球组培苗进行了GLRaV-3病毒检测。研究结果表明：红地球葡萄茎尖培养脱毒最佳茎尖初始培养基为：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L,最佳茎尖分化培养基为：B5+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;茎尖大小与成活率成正比,与脱毒率成反比;运用RT-PCR检测技术进行了脱毒后组培苗的检测,得到了GLRaV-3的特异片段为300 bp,获得了28株脱毒苗,平均脱毒率为43%。     

宁糯芋1号茎尖离体培养条件优化

为丰富福建省优质芋种源，加快优良品种推广应用，以‘宁糯芋1号’块茎顶芽和侧芽为外植体，运用茎尖分生组织培养获得了不定芽。在正交试验基础上，根据响应面分析法中心组合试验，以不定芽增殖系数为响应值，对TDZ、温度2因素进行优化，结果发现：与6-BA相比，TDZ更适于芋茎尖诱导丛芽，在MS培养基中附加0.1~0.2 mg/L的TDZ能显著促进芋茎尖的萌动，成苗率达76.7%~80.0%，经芋花叶病毒(DMV)检测试剂盒的ELISA检测表明脱毒率为90%；响应面优化结果表明，‘宁糯芋1号’不定芽继代增殖的最佳培养条件为 MS+TDZ0.31 mg/L，培养温度30.32℃，增殖系数预测值为9.08，验证得到的实际值为8.86。利用响应面方法可有效优化‘宁糯芋1号’不定芽继代增殖培养条件。     

利用RT-PCR对黄瓜病毒病毒原种类进行检测

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶序列和西瓜花叶病毒2号(WMV-2)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜绿斑花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因序列以及南瓜花叶病毒(SQMV)的运动蛋白序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增。对2002～2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果表明,天津地区黄瓜主要毒原种类有CMV,WMV-2和TMV,感染率分别为样本数的96．94％,77．55％和38．67％,CMV和WMV-2 2种病毒的复合感染率为76．53％,3种病毒的复合感染率达到14．67％。     

草石蚕(Stachys sieboldii)脱毒快繁技术体系建立

以务川草石蚕茎尖为外植体,研究了茎尖长度、热处理温度和时间对草石蚕脱毒的影响,并建立草石蚕脱毒快繁技术体系。结果表明,随草石蚕茎尖长度减小,脱毒率升高,但成苗率降低;以0.5 mm茎尖长度为最佳,成苗率和脱毒率分别为51.7%和38.7%。0.5 mm茎尖经50℃处理30 min后,其脱毒率可提高到60.0%。1.0 mm茎尖在40℃培养20 d后的脱毒效果最佳,可达88.37%。已脱毒芽增殖的最佳培养基为MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 5 mg/L+GA_3 1.5 mg/L;生根最优培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L+GA_3 0.5 mg/L。本研究建立了草石蚕脱毒快繁的技术体系,可为草石蚕脱毒苗的快速繁殖提供技术参考。     

烟蚜传播黄瓜绿斑驳花叶病毒的可能性及方式

为确定烟蚜体内携带的是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）,采用RT-PCR和序列测定方法对其进行鉴定。本研究通过采集湖南宁乡、郴州、浏阳三个地区的田间烟蚜,提取RNA后反转录成cDNA,并以cDNA作为模板,通过设计引物进行PCR扩增,摇菌后测序。测序结果显示,在烟蚜体内扩增出与黄瓜绿斑驳花叶病毒相似度为99%的RNA病毒。对包括该分离物在内的22个基因核苷酸序列进行同源性比较和系统进化树构建,并结合地域来源进行分析,结果表明烟蚜体内的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)来源于其携带的CGMMV。通过分析推测,烟蚜可传播黄瓜绿斑驳花叶病毒,且传毒方式为持久性。     

草石蚕的茎尖分生组织培养和脱病毒系的应用价值

草石蚕(Stachys sieboldii Miq.)是我国的特产蔬菜之一.病毒侵染是引起草石蚕种性退化的主要原因.经血清学和电镜鉴定,北京地区的草石蚕至少受到三种病毒感染,即苜蓿花叶病毒(AMV)、烟草花叶病毒(TMV)和另一种不知名的长线条形病毒.为了恢复草石蚕原有的种性,采用茎尖分生组织培养技术成功地获得了脱病毒植株.用试管苗茎段扦插法离体快速繁殖优良脱毒母株,理论上年繁殖率可达5,000万倍以上.离体贮存试验表明,可将脱毒母株在23±2℃的培养室内离体保存8—9个月.1985年小面积试种结果:脱毒系每公顷产31.15吨,块茎单重4.16克,分别比罹毒母系增加1.7倍和1.2倍.块茎营养分析表明,脱毒系粗蛋白含量达21.62%,较罹病毒系高39.57%,氨基酸总含量平均增加30%以上.本文最后还讨论了草石蚕组培脱毒技术的应用问题.