白花虎眼万年青QtCIGR1基因的克隆及功能分析

CIGR(Chitin-inducible gibberellin-responsive gene)基因是植物GRAS基因家族的重要成员,在植物器官发育中发挥重要作用,然而在百合科植物等鳞茎球根花卉中尚未见到报道。本研究从百合科植物白花虎眼万年青叶上珠芽中分离出CIGR基因及其基因家族成员,进行氨基酸保守序列比对及系统进化分析后,将其命名为QtCIGR1基因;将其置于UBI启动子下在烟草中超量表达,转基因烟草的节间显著伸长及直径明显增粗,幼叶形状也发生了明显的变化,表明QtCIGR1基因对植物的节间伸长和直径增粗具有明显调控作用,可能在白花虎眼万年青的珠芽、节间和花茎等器官发育过程中发挥着重要作用。     

白花虎眼万年青QtKN1基因的克隆及功能分析

在离体条件下,白花虎眼万年青的叶片表面可以产生多个珠芽,即叶上珠芽。KNOXI基因是真核生物中高度保守的同源盒转录因子,在植物的珠芽等器官发生中起着重要作用。为了探析白花虎眼万年青叶上珠芽的发生机制,我们从中克隆出了其同源基因,通过对其编码的蛋白质序列比对和系统发育分析,认为其属于KNOXI在白花虎眼万年青中的同源基因,将其命名为Qt KNI基因。将其转入烟草后,导致叶片边缘浅裂、边缘缺失、形状卵形且叶脉紊乱等多种表型。以上研究说明Qt KNI基因可能在白花虎眼万年青的珠芽等器官发育中起着重要作用,并且在生物技术中具有潜在的应用价值。     

白花虎眼万年青

照片上的鲜花,是不是非常优雅别致? 它是一种原产南非的新型优良插瓶花——白花虎眼万年青(Ornithogalum thyroides)。此花种从国外引入我国栽培应用时,市场上误称之为“雀梅”,该错名应即废弃不用。如嫌“白花虎跟万年青”之正名太长,可考虑增一新异名——“雪睛青”。此花另有一异名,称好望角鸟乳花。笔者曾在北京露地和温室种过白花虎眼万年青,并几次用其盛开的花序进行花卉装饰。经过年来的繁殖、栽培及应用,深感它确系一新型优良切花。爰写此小文,向读者和国内花卉界推荐。白花虎眼万年青是百合科虎眼万年青属Ornithogalum的一种球根花卉。该属植物全球共约100种以上,此花乃其中的佼佼者。其     

白花虎眼万年青绿原酸合成酶基因QtHQT的克隆及表达分析

羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶(hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinamoyl transferase,HQT)是植物绿原酸合成过程中的关键酶。为研究HQT基因在白花虎眼万年青绿原酸合成中的分子机理,根据已获得的白花虎眼万年青转录组数据中的HQT基因序列,设计引物,利用RT-PCR方法获得白花虎眼万年青HQT基因的完整编码区序列;对该基因进行了生物信息学分析,并采用相对定量PCR方法分析了其在不同器官中的表达特性。研究结果表明,分离出的白花虎眼万年青HQT基因长1 284 bp,编码427个氨基酸并包括应有的保守区域,命名为Qt HQT;Qt HQT基因在白花虎眼万年青的鳞茎中表达量最高,珠芽其次,叶片中最低。本研究从白花虎眼万年青中克隆了Qt HQT基因,并对其进行了生物信息学和相对表达量分析,为后续研究奠定了基础。     

白花虎眼万年青QtJMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

茉莉酸及其甲基化的衍生产物茉莉酸甲酯,后者具有较高生物活性,在植物的生命活动过程中发挥重要作用。茉莉酸甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase, JMT)作为甲基转移酶类家族中的重要成员,是将茉莉酸甲基化衍生为茉莉酸甲酯过程中发挥催化作用的关键酶,过表达能够使得植物内源茉莉酸甲酯的生物合成能力增强,内源茉莉酸甲酯的含量提高,进而增强植物抗逆性及提高植物次生代谢物质含量,以及调控植物生长发育。白花虎眼万年青具有抗逆性强、次生代谢物质丰富、以及器官再生方式独特等特点,可能具有较高生物活性的茉莉酸甲基转移酶及其分子机制,但是尚未见到报道。本研究根据白花虎眼万年青叶上珠芽转录组分析数据,设计引物,克隆分离出茉莉酸甲基转移酶基因完整编码区,进而对其进行了三维立体结构、蛋白质保守序列及系统发育等生物信息学分析,将其命名为QtJMT基因,并成功将其连接到泛素启动子(pUB)驱动的植物表达载体上。本研究结果为QtJMT基因的深入分析其功能及在花卉分子育种中的应用提供了一定的依据。     

白花虎眼万年青叶上珠芽的转录组分析

白花虎眼万年青可在离体条件下以叶片表面上产生多个珠芽方式实现高效再生,"叶上生根,落地成苗",为解决植物困难再生的问题提供了新的思路和途径,但是其形成机制尚不清楚。本研究以其叶片及其表面产生的珠芽为研究材料,进行Illumina Hi Seq 2000测序分析。共获得原始数据9.13 G,经过数据过滤后得到有效数据7.67 G,及178 385条Unigene。研究表明,叶片产生珠芽过程中有2 397条Unigene上调,1 593条Unigene下调;EMB基因、TATA结合蛋白、BTB/POZ锚蛋白重复序列、TOR调控蛋白、FKBP蛋白等基因的表达发生了明显地变化,可能参与了珠芽的形成。本研究首次获得了白花虎眼万年青叶上珠芽的转录组数据,分析了叶片中可能参与形成珠芽的重要功能基因,为探讨叶上珠芽发育的分子机制及进行重要功能基因的挖掘提供了分子数据。     

虎眼万年青鳞茎转录组特性分析

虎眼万年青具有很高的药用价值和经济价值,鳞茎是其主要的药用和繁殖器官,然而虎眼万年青鳞茎的分子生物学信息严重缺乏成为制约其研究生产的瓶颈。为获得虎眼万年青鳞茎的转录组信息,应用高通量测序技术对虎眼万年青鳞茎进行测序分析。采用His4000测序平台共获得8.2 G原始数据,经过整理分析后,获得7.6 G有效数据和121 223条Unigene;经过与NR、GO、COG及KEGG等数据库进行比较分析后,56 374条Unigene获得NR数据库的注释,39 263条Unigene获得GO数据库的注释,12 388条Unigene获得COG功能注释,5 405条Unigene参与了新陈代谢途径,2 477条Unigene参与了次生代谢途径,166条Unigene参与了萜类的合成,195条Unigene参与了生物碱的合成,295条Unigene作为转录因子参与新陈代谢过程调控。研究结果为采用生物技术手段提高虎眼万年青的药用成分的含量及改善其园艺性状提供了分子数据。     

白花虎眼万年青QtNPY4组成型表达对烟草叶片形态的影响

白花虎眼万年青的离体叶片在细胞分裂素作用下叶片表面产生多个珠芽,即"叶上珠芽",其再生机制尚需阐明。白花虎眼万年青叶上珠芽转录组分析表明,NPY基因在该过程中发挥了重要作用;NPY基因是BTB基因家族的重要成员,在生长素调控下参与了器官发生。为了探析白花虎眼万年青叶上珠芽的发生机制,我们将来自白花虎眼万年青的叶上珠芽的QtNPY4基因置于泛素启动下在烟草中持续表达,在细胞分裂素调控下转基因烟草出现了叶片浅裂、倒卵形甚至叶脉长芽等多种表型。以上研究说明QtNPY4基因具有调控维管束发育和茎尖分生组织活性的功能,能提高植物的再生能力,能赋予或提高叶表维管束分化和再生能力并且受细胞分裂素调控;可能在白花虎眼万年青的叶上珠芽的形成和发育过程中发挥重要作用,在生物技术中具有潜在的应用价值。     

甘蓝型油菜BnABCG8基因的克隆及表达分析

甘蓝型油菜是重要的油料作物之一,随着对油脂需求的日益增加,高含油量油菜育种有着很重要的现实意义。本研究克隆了甘蓝型油菜BnABCG8基因,全长1 722 bp,编码573个氨基酸。通过生物信息学分析,发现BnABCG8蛋白是一类典型的半分子ABC转运蛋白,具有"NBD-TMD"排列的结构域特点。系统进化分析表明,BnABCG8与拟南芥ABCG(WBC)亚家族亲缘关系较近。半定量PCR以及荧光定量PCR发现,BnABCG8基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花以及长角果等不同部位均有表达,在长角果中表达量最高,意味着BnABCG8极有可能参与脂质的运输调控植物的生长发育。     

葡萄VvMSA基因的克隆及表达特性分析

为了解VvMSA基因的功能,以抗性葡萄品种Vidal Blanc组培苗为试材,克隆得到VvMSA基因,对其序列进行了生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析了其组织表达特性和多种非生物胁迫和信号应答表达特性。结果表明,VvMSA基因片段大小为450 bp,编码149个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示,VvMSA蛋白分子量约为16.703 k Da,等电点为5.68,不稳定系数为41.71,推测为不稳定蛋白。VvMSA含有65个氨基酸组成的ABA/WDS保守结构域。在进化上属于单独一个分支,它和已报道过的番茄Le ASR1分别属于同一个祖先进化出的2个分支。实时荧光定量PCR分析显示,VvMSA在葡萄不同组织中均有表达,花中表达量最高。多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等能诱导VvMSA不同程度的上调表达,盐胁迫3 h时诱导表达量最高。同时,VvMSA受逆境胁迫信号分子NO和H_2S不同程度诱导表达上调,而SA则抑制VvMSA表达。激素ABA、GA_3、IAA和ET均能不同程度诱导VvMSA表达上调,并且VvMSA盐处理下的表达模式与ABA诱导的类似。综合以上结果推断VvMSA可能通过调控ABA信号途径来调节葡萄对盐胁迫应答。     

苹果UV-B受体基因UVR8的克隆及生物信息学分析

本研究以‘富士’苹果红色芽变品种‘烟富8’果皮为试验材料,采用RT-PCR方法,克隆获得苹果UV-B受体基因UVR8的全长序列,命名为Md UVR8。结果显示,开放阅读框长度为1 359 bp,编码452个氨基酸,相对分子质量48.487 k D,等电点(PI)为5.56。蛋白质保守域分析表明,苹果UVR8蛋白包含7个RCC1结构域。蛋白质二级结构预测显示,苹果UVR8蛋白含有10个琢-螺旋,16个茁折叠,41个茁-转角。氨基酸同源性比对分析表明,苹果UVR8与已报道的其他植物的氨基酸序列相似性在69.54%~88.94%之间。核苷酸聚类分析表明,苹果和白梨首先聚为一类,其次是梅。本研究为苹果光受体对光应答的分子机理的进一步研究奠定了基础。     

甜瓜CmERFV-4基因cDNA克隆及特性分析

乙稀应答因子(ethylene-responsive factor,ERF)是乙烯信号通路中的组分之一,通过认别并结合下游功能基因启动子顺式作用元件GCC-box,从而实现对植物发育的调控和逆境胁迫的响应。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜为研究材料,从成熟甜瓜果实中克隆得到554 bp的CmERFV-4基因cDNA,基于该cDNA序列,进行了蛋白理化性质、空间结构与系统进化分析。实时荧光定量PCR检测表明,在不同组织检测结果中CmERFV-4基因在子叶中的表达量最高,在不同发育阶段果实检测结果中该基因在授粉后40 d果实中的表达量最高。构建了该基因超表达载体和RNAi载体。     

大白菜FAD8基因的克隆

脂肪酸去饱和酶基因FAD8是控制亚油酸向亚麻酸转换的关键酶,对植物的膜脂不饱和度有重要影响,关系到植物的抗寒能力,在拟南芥中是低温诱导表达的。根据已发表的FAD8序列,设计简并引物,从低温处理条件下大白菜叶片cDNA中克隆到一段200 bp的中间序列,进一步利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cD-NA ends,RACE),获得大白菜FAD8基因的5’和3’末端序列,经测序拼接获得1 509 bp的目的序列,编码432个氨基酸。与已经报导的油菜FAD8基因氨基酸序列同源性较高,达98%。杂交结果显示,该基因是单拷贝序列。这项工作为进一步研究叶绿体脂肪酸去饱和酶奠定了一定的基础。     

海岛棉DAHP基因的克隆及分子特性分析

棉花黄萎病严重影响中国的棉花产量和品质。本研究以海岛棉cDNA为模板扩增得到3个DAHP基因片段,分别命名为GbDAHP-1、GbDAHP-6、GbDAHP-7。序列分析显示,GbDAHP-1基因全长为1 755 bp,编码539个氨基酸,理论分子量为59.4 kD,等电点为8.70;GbDAHP-6基因全长为1 644 bp,编码519个氨基酸,理论分子量为57.176 11 kD,等电点为8.94;GbDAHP-7基因全长为1 554 bp,编码517个氨基酸,理论分子量约为57.177 14 kD,等电点为8.12。通过在线软件分析得知3个蛋白质的理化性质相似,均为亲水性蛋白,不含跨膜运输结构域,位于叶绿体。系统发育树显示：GbDAHP-1、GbDAHP-6和GbDAHP-7基因与陆地棉、雷蒙德氏棉、可可的序列相似度较高,与陆地棉以及雷蒙德氏棉的蛋白质相似度最高,亲缘关系最近。在黄萎病菌诱导下GbDAHP基因显示先上升后下降的趋势,表明该基因受到黄萎病菌诱导表达。     

海岛棉GbWRKY32基因的克隆及特性分析

利用RT-PCR技术从海岛棉品种新海21中克隆了1个WRKY基因,在GenBank数据库中比对发现其与陆地棉GhWRKY32的序列高度同源,因此命名为GbWRKY32。该基因ORF为1 077 bp,编码358氨基酸,预测分子量为39.288 k D,等电点为5.02。序列分析表明该基因含有一个WRKY保守结构域,锌指结构为:C-X5-C-X23-H-X1-H,属于WRKY转录因子家族Ⅱ类D组成员。GbWRKY32蛋白为疏水性蛋白,不具有跨膜区和信号肽结构。GbWRKY32转录因子不具有转录自激活活性。本研究成功构建GbWRKY32基因的植物表达载体并转入根癌农杆菌EHA105菌株中,这有助于该基因功能的后续研究。     

月季RhMYB61基因的克隆及表达特性分析

为了研究月季MYB类转录因子在月季花朵开放中的分子特征和表达特性,利用转录组测序获得的序列信息,结合RACE技术,从切花月季萨蔓莎中分离获得一个MYB类型的转录因子基因,命名为Rh MYB61(登录号KY921844)。该基因ORF区包含1 323 bp,编码441个aa,分子量为49.1 k Da,等电点为7.66,公式C2123H3280N620O688S18。系统进化树分析表明,Rh MYB61与桃树中的Pp MYB86和枇杷Ej MYB8聚为一类,属于R2R3-MYB类型转录因子,进一步的蛋白序列多重比较发现,Rh MYB61在N端具有保守的R2-MYB和R3-MYB区域,包含有7个保守的基序,在R3-MYB区域包含有核定位序列。利用实时定量PCR技术分析了Rh MYB61的时空表达模式,结果显示,随着开花级数的增加,Rh MYB61的表达特性呈逐渐增加的趋势,在开花级数5级时表达倍数最高;失水12 h处理提高了Rh MYB61的表达倍数;与对照相比较,乙烯处理6,12,24 h显著提高了Rh MYB61的表达特性,1-MCP则显著抑制了其表达。上述结果为月季Rh MYB61生物学功能的研究奠定了基础,同时也为今后月季的分子育种研究提供了理论参考。     

枸杞LbMYB12基因的克隆及表达特性分析

类黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物,枸杞黄酮以其强抗氧化作用以及对心脑血管疾病的抑制和改善功能而广为人知。MYB转录因子参与类黄酮代谢过程的调控。本研究采用RACE技术克隆了枸杞LbMYB12基因全长cDNA序列。生物信息学分析表明,LbMYB12基因的完整开放阅读框(ORF)长930 bp,具有MYB蛋白家族保守结构域,蛋白质相对分子量为35.56 kD,等电点为5.05,其二级结构主要为α-螺旋。荧光定量PCR分析表明,LbMYB12基因在枸杞整个植株中均有表达。其中,在根中的表达量最低,在青果中的表达量最高。LbMYB12基因在果实不同发育时期的表达分析表明,开花后早期表达量显著高于成熟期果实。本研究为进一步探讨枸杞LbMYB12转录因子在类黄酮代谢中的作用提供了研究基础。     

陆地棉GhERF8基因的克隆与表达分析

 乙烯响应元件结合因子（Ethylene-responsive element-binding factor,ERF）是植物中最大的转录因子家族之一。本研究以棉花叶片cDNA文库为基础,从陆地棉中棉所10号中克隆得到一个新的ERF基因,命名为GhERF8（GenBank：JN656957）。该基因编码265个氨基酸,蛋白序列中包含一个AP2保守结构域。采用荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,对GhERF8基因在棉株不同生育时期叶片和不同组织中的表达水平进行了定量分析。结果表明,GhERF8基因在各组织中均有表达,但在成熟后期的叶片中表达量最高。GhERF8表达量与叶片衰老过程中叶绿素含量出现相反的变化趋势,推测GhERF8可能与叶片衰老有一定关系。在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF8基因在叶片中上调表达,而在脱落酸处理下GhERF8表达量无显著变化,推测GhERF8可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中,且表达途径为非ABA依赖途径。