转录组分析揭示热激诱导家蚕孤雌生殖发生相关的信号通路

为了筛选热激诱导家蚕非减数分裂孤雌生殖(ameiotic parthenogenesis)发生相关的基因和关键信号通路,应用Illumina HiSeq X Ten平台对具有高发生率和高孵化率的孤雌生殖系与低发生率和低孵化率的两性生殖系亲本在热激诱导前后的未受精卵进行转录组测序和比较分析。热激诱导前后分别鉴定到差异表达基因4 477与6 196个。热激诱导前差异表达基因主要涉及卵子发生、绒毛膜、卵壳形成等过程,暗示热激前孤雌生殖系和两性生殖系在发育水平上存在差异。热激诱导后差异表达基因主要富集在膜组成部分,参与信号转导通路的差异表达基因最多,主要富集在cAMP、PI3K-Akt、MAPK、Ras等信号通路,这些通路与热激响应和减数分裂有关,推测热激可能通过cAMP等信号通路调控减数分裂过程参与孤雌生殖的发生。本研究有助于进一步探索复杂的孤雌生殖诱导发生机制。     

诱发滞育的温度和光照条件对家蚕胚胎生物钟信号主要基因表达的影响

为了深入研究温度和光照等昼夜节律授时因子对家蚕滞育的调控机制,以常规诱导滞育发生的温度与光照条件处理胚胎发育后期蚕卵,调查家蚕胚胎生物钟信号环路主要基因Cry1、Cry2、Per和Tim的表达对授时因子振荡变化的响应。结果显示:光照能够上调Cry1基因在家蚕胚胎发育后期的表达,温度则可改变该基因表达的振荡周期相位;温度在改变Cry2基因振荡表达相位的同时,低温(15℃)还能上调该基因在家蚕胚胎发育后期的表达;温度升高可缩短Per基因表达的振荡周期;黑暗诱导Tim基因振荡表达,温度则能够改变Tim基因表达的振荡周期相位。结果提示:家蚕胚胎中可能存在与其他昆虫类似的以CRY1为光感受器因子的生物钟信号环路,Cry1、Cry2、Per和Tim是家蚕胚胎期能够响应昼夜节律授时因子光照和温度而诱导滞育发生的生物钟基因。     

Hippo信号通路对家蚕体壁发育和细胞增殖的调控

Hippo信号通路最早是在果蝇中发现的,在组织器官的发育调控中起重要作用,信号通路中的一些基因还被鉴定为肿瘤抑制基因。这个信号通路在果蝇和小鼠中得到广泛关注,但是在家蚕中关注甚少。西南大学的LIN等人在家蚕中鉴定了Hippo信号通路的主要相关基因(Hippo,Salvador,Warts,Mats,Yorkie)并命名为BmHpo,BmSav,BmWts,BmMats,Bm Yki。这些基因在家蚕和其他生物中高度保守,说明它们通过相似的蛋白质相互作用建立Hippo信号通路。研究中分析了这些基因在家蚕胚胎,幼虫、游走期、蛹期及蛾期的时期表达模式,以及在幼虫5龄3天的14个组织中的组织表达情况。研究结果表明Hippo信号通路对家蚕的发育是有影响的。为了了解Hippo信号通路调控家蚕发育的分子机制,作者在家蚕卵巢细胞系(BmN-SWU1,NS)中分别上调和下调表达了BmHpo和BmYki基因,发现细胞增殖活性和细胞周期发生了改变。该研究发现Hippo信号通路的基因在家蚕表皮发育及细胞增殖方面有重要作用。     

家蚕Toll和IMD信号通路重要基因对不同病原体感染的免疫响应

Toll和IMD通路是昆虫先天免疫的重要信号通路，抗菌肽的产生可以由这些通路激活。通过感染4种不同种类的病原体(球孢白僵菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌),对家蚕Toll通路的BmTube、BmMyD88、BmTollip、BmECSIT、BmTRAF2和BmCactus基因，IMD通路的BmDredd、BmFadd、BmTAB2、BmTAK1、BmRelish1和BmRelish2基因以及4类不同抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)基因BmCecropinA1、BmAttacin1、BmDefensinA和BmGloverin1的表达进行分析，探讨家蚕在感染不同病原后Toll和IMD通路级联反应的免疫响应。结果表明，家蚕Toll和IMD信号通路级联反应基因表达调控与不同种类病原体感染相关；不同类型的病原选择性地激活Toll和IMD通路，进而诱导特定AMP基因的表达，AMP基因表达对细菌的免疫响应快，对真菌的免疫响应慢，其中BmCecropinA1表达强度显著高于其他类型AMP基因。     

重要外文学术期刊发表蚕学论文简介

正1 LI K,TIAN L,GUO Z,GUO S,ZHANG J,GU S H,PALLI S R,CAO Y,LI S.20-Hydroxyecdysone(20E)primary response gene E75 isoforms mediate steroidogenesis autoregulation and regulate developmental timing in Bombyx.J Biol Chem,2016,291(35):18163-18175题目蜕皮激素(20E)主要应答基因E75各亚型参与类固醇生物合成的自动调节并精确调控家蚕发育过程摘要昆虫的蜕皮和变态发育过程受蜕皮激素20E的调控。20E通过反馈调控机制使蜕皮激素生物合成达到峰值,但其分子机制还不清楚。以家蚕作为实验材料,中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究     

用保幼激素和蜕皮激素处理离体培养家蚕丝腺对丝蛋白基因表达的影响

蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)具有共同调控家蚕丝蛋白合成的作用。将家蚕5龄第3天幼虫的中部和后部丝腺置于含不同浓度20E或JH的培养基中进行离体培养,于培养不同时间通过定量PCR检测丝素蛋白基因及丝胶蛋白基因的表达变化。结果表明,蜕皮激素处理对丝蛋白基因表达的影响,因激素使用剂量和作用时间不同而异;保幼激素处理会抑制丝蛋白基因的表达,尤其对丝素蛋白重链基因Bmfib-H的表达抑制作用更为明显,50 ng/m L JH处理48 h后Bmfib-H的表达水平下调1倍左右;蜕皮激素和保幼激素共同处理比单一激素处理更有助于丝蛋白基因的表达,但用保幼激素先处理丝腺24 h后再用蜕皮激素和保幼激素共同处理,会显著抑制丝素蛋白轻链基因Bmfib-L的表达。试验在排除蚕体内源激素干扰的条件下,从转录水平初步分析了保幼激素和蜕皮激素对家蚕丝蛋白基因表达的调控机制。     

滞育诱导温度和光照节律对家蚕sod基因和cat基因的表达的影响

家蚕(Bombyxmori)是卵滞育性鳞翅目模式昆虫,其滞育性受亲代卵孵化期(催青期)温度、光节律等环境因子诱导。为了研究家蚕滞育与温度和光照节律的关系,本文调查了温度、光照节律对家蚕sod基因和cat基因表达的影响。催青期中除了孵化期,25℃持续光照下(25LL)卵的sodmRNA均保持在较高水平,另外,sod基因在20℃光照黑暗(20LD)12h交替环境下的表达量要高于15℃持续黑暗(15DD)条件,且孵化后期这种现象更加明显。cat基因在25LL、20LD和15DD环境之间的表达量无差异,但是孵化后期(积温2160-3600℃.h),cat基因表达水平显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光节律比较敏感的结论相一致。此外,本文还调查了子代卵中sod基因和cat基因的表达情况。sod基因在人工活化卵(DTE)中的表达水平显著高于非浸酸的滞育性卵(DDE);卵龄24-192h,25LL子代卵逐渐进入滞育,sod基因表达量下调。低温黑暗条件会上调家蚕子代卵sod基因的表达水平。在初期的盐酸活化卵(DTE)中,cat表达量低于滞育卵(DDE),而后逐渐上升,直至接近滞育卵表达量,这表明盐酸可能会抑制cat基因表达。在恒温条件下,黑暗条件会促进子代卵上调cat表达。在温度光照协同作用下,20LD子代卵中cat表达量低于25LL和15DD。     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。     

牛胚胎角芽组织基因表达特征分析

[目的] 通过基因表达特征的分析,揭示在形成牛胚胎角芽组织中起关键作用的基因和通路,从而更深入地了解角芽发育过程中的分子机制。[方法] 基于牛胚胎角芽组织、额部皮肤组织、脑、心脏、肾、肝脏、肺、瘤胃、骨骼肌、脾脏的转录组测序数据,利用主成分分析(PCA)、差异表达基因分析和基因富集分析来解析角芽组织的基因表达特征。 [结果] 多组织基因表达比较鉴定到810个角芽组织特异高表达基因。主成分分析表明牛胚胎角芽组织与额部皮肤组织的基因表达模式最为相似,但存在1695个显著上调基因（校正p<=0.05), 这些基因功能富集到与神经和骨发育相关的通路。[结论] 从多组织比较、角芽组织和额部皮肤的差异比较两个方面分别鉴定了角芽组织的基因表达特征,角芽组织特异高表达基因富集到骨、神经和皮肤发育相关通路,暗示着角芽组织发育涉及多组织协同,具有复杂的调控机制。     

家蚕翅原基发育关联基因BmHMGS的鉴定与表达特征分析

家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质谱分析在20E诱导组的翅原基中获得132种差异蛋白,在未经20E诱导组的翅原基中获得76种差异蛋白。进一步通过生物信息学技术及GO分类法在20E诱导组的翅原基的差异蛋白中,筛选到1个具有生物调节作用的酶类蛋白基因Bm HMGS作为翅原基发育相关的候选基因,设计引物并以上蔟1 d的蚕体翅原基总RNA反转录得到的c DNA为模板,克隆了该基因。通过qRT-PCR检测到Bm HMGS基因在幼虫5龄1 d、上蔟3 d、蛹期1 d蚕体内的表达量较高,其中在上蔟3 d的表达量达到峰值。构建重组载体进行Bm HMGS的原核表达并制备抗体后,采用Western blot技术在5龄1~7 d和上蔟1~3 d的蚕体翅原基、脂肪体中及上蔟1~3 d的生殖腺中都可以检测到Bm HMGS的表达,并且在翅原基中的表达没有发育时期特异性。研究结果表明,从20E诱导组的家蚕翅原基中鉴定的Bm HMGS与翅原基发育相关,其表达在5龄至上蔟阶段没有时期和组织的特异性,推测Bm HMGS是一个具有多种生物学功能的基因。     

滞育诱导温度与光照对家蚕近日节律基因per表达的影响

温度和光照是昆虫近日节律基因表达的授时因子,也是影响家蚕滞育的决定因素。为了解家蚕滞育与近日节律调控的关系,研究了滞育诱导发生温度与光照对家蚕近日节律基因per表达的影响。家蚕整个世代在25℃高温环境下,或幼虫期与蛹期在20℃的较高温度下,per基因在黑暗环境中的转录水平高于光照环境。家蚕幼虫及蛹期在相同光照条件下,per基因转录水平在高温环境中高于低温环境,黑暗环境下又呈现20℃25℃15℃的变化趋势,且温度的影响大于黑暗环境;在25℃持续光照条件(25LL)下,胚后时期per基因的表达水平高于15℃持续黑暗的条件(15DD),而20℃及光照与黑暗各12 h条件(20LD)下变化更加敏感,这与温度和光照对家蚕滞育的诱导作用一致。在处女蛾和卵产出后0.5 h的未受精蚕卵中都检测到了高水平的母源per基因mRNA。亲代卵催青期的单因子25℃高温或黑暗、以及20LD,都会引起子代卵内per基因mRNA水平的上调,这种上调只出现在滞育出现或活化发育的转折时间点(卵龄72 h)之前。家蚕滞育诱导温度和光照条件直接影响per基因在整个世代的差异表达,该基因在卵期的表达与胚胎滞育性差异密切关联。     

家蚕近等基因系感染浓核病毒(BmDNV-Z)前后中肠组织蛋白的差异表达分析

家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。     

梅山猪与杜洛克猪中等卵泡差异表达基因的鉴定

本试验采用抑制性消减杂交技术构建了卵泡期第4天梅山猪和杜洛克猪中等卵泡M2组织差异表达的消减cDNA文库,从中筛选差异表达的基因,并通过实时荧光定量PCR对其进行验证,利用DAVID软件对差异表达的基因进行聚类分析。结果表明,从梅山猪和杜洛克猪M2卵泡消减文库中筛选得到了148和75个差异表达的ESTs,分别含有125和60个已知的基因。实时荧光定量PCR验证结果与筛选结果相符。GO功能分类注释到调控代谢、细胞循环、生物合成、胞内转运、类固醇雌激素受体和刺激等生物学过程。KEGG Pathway分析表明有6个基因参与TGF-beta信号通路,5个基因参与卵母细胞减数分裂信号通路,7个基因参与类固醇雌激素受体信号通路,推测TGF-beta信号通路中的基因可能调控猪卵泡的发育。研究结果为深入探讨卵泡发育机理和对繁殖性状影响的遗传机理奠定了基础。     

基于转录组测序鉴定雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因

本研究旨在通过转录组测序（RNA-seq）鉴定雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因,为确定雌性鸡胚性腺不对称发育的分子机制提供参考。随机选择6胚龄（E6）和8胚龄（E8）的雌鸡胚胎各18～24只,分离并采集其两侧性腺,每6～8个同侧同期性腺组成一个样品,匀浆后提取总RNA经质控后送商业公司进行转录组测序。每个样品3个生物学重复。通过基因差异表达分析,GO、KEGG信号通路分析和基因集变异分析（GSVA）,筛选雌性鸡胚性腺不对称发育相关候选基因和生物学通路。经实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对筛选出的差异表达基因进行验证。转录组差异表达分析结果显示雌性鸡胚左右两侧性腺在E6和E8分别存在195个和315个差异表达基因。GO功能富集和KEGG信号通路富集分析发现两侧性腺差异表达基因主要富集在卵子发生、细胞发育、piRNA代谢过程等生物学过程并筛选出Pou5f3、STK31、DMRTB1等与鸡胚性腺不对称发育相关的功能基因。本研究为进一步研究雌性鸡胚性腺不对称发育的分子调控机制提供了参考。     

短时高温处理对意大利蝗卵子发生期HSP70蛋白表达的影响

本研究采用免疫组织化学分析方法,测定了HSP70蛋白在意大利蝗卵子发生期的表达定位及33~42℃高温处理对其相对表达量的影响。结果表明,1)在卵黄发生前期,卵母细胞和滤泡细胞均表达HSP70蛋白,而在卵黄发生期和卵黄发生后期,HSP70蛋白阳性表达位于滤泡细胞;2)在33~42℃温度范围内,随着温度升高,意大利蝗卵子发生期HSP70蛋白相对表达量呈现先上升后下降的变化趋势;其中36℃处理组HSP70蛋白相对表达量最高,显著高于27℃对照组(P0.05);42℃处理组HSP70蛋白相对表达量最低,但与27℃对照组差异不显著(P0.05)。短时高温处理对意大利蝗卵子发生期HSP70蛋白相对表达量有显著影响,推测HSP70蛋白的表达在意大利蝗抵抗短时高温胁迫过程中具有重要作用。     

家蚕成虫雌雄差异的基因表达分析

研究家蚕成虫雌雄差异的基因表达,可为探究家蚕以及鳞翅目昆虫雌雄差异的分子机制提供线索。利用家蚕全基因组芯片检测家蚕成虫雌雄差异基因表达谱,并采用聚类及功能注释对芯片检测结果进行分析。结果显示有11677个基因在家蚕成虫中表达,其中有3312个基因在雄性个体表达上调,4254个在雌性个体表达上调。雌雄个体中表达上调基因的GO分类比较显示这2类基因在分子伴侣调控、电子载体等功能方面差异较大。在雌雄差异基因的功能注释中发现了与性腺特异性、发育繁殖及选择拼接因子等相关的基因。家蚕成虫存在的与雌雄个体特异相关的差异表达基因,可作为家蚕雌雄个体性别相关的生物遗传学标志。     

藏鸡和科宝肉鸡鸡胚卵黄膜、尿囊膜HIF-HIF-2α和VEGF基因表达的比较分析

藏鸡和肉鸡在耐低氧性状上有明显的差异,但对品种间这种差异的机制研究还未见报道。试验通过RT-PCR对高原低氧孵化的藏鸡和常氧孵化的肉鸡(科宝500)14日胚龄鸡胚卵黄膜、尿囊膜(CAM)HIF-2α和VEGF m RNA表达量进行检测和比较,从分子水平上分析不同品种之间的表达差异。结果发现藏鸡鸡胚卵黄膜和CAM组织中HIF-2αm RNA表达量均显著高于肉鸡鸡胚卵黄膜、CAM内表达(P0.05)。藏鸡鸡胚CAM组织中VEGF m RNA表达量显著高于肉鸡CAM内表达(P0.05),而卵黄膜组织中VEGF m RNA表达没有显著差异。藏鸡与肉鸡卵黄膜、CAM组织中HIF-2α和VEGF基因表达量均不相关。结果提示,HIF-2α基因在藏鸡鸡胚卵黄膜、CAM均高度表达,可能是藏鸡对低氧适应的结果;而VEGF基因在藏鸡CAM高度表达,这可能更有利于藏鸡鸡胚CAM血管的形成,进而提高藏鸡在高原低氧环境中的适应能力。藏鸡与肉鸡鸡胚卵黄膜、CAM组织HIF-2α和VEGF基因可能通过不同的途径发挥作用。     

基于RNA-Seq分析食欲素A对绵羊卵巢黄体化颗粒细胞基因表达的影响

食欲素A(orexin A)作为一种重要的神经肽类激素,通过与G蛋白耦联受体结合影响生殖功能。为了研究orexin A对绵羊黄体化颗粒细胞基因表达的影响及其信号网络,培养绵羊卵巢黄体化颗粒细胞进行鉴定,提取黄体化颗粒细胞组和添加Orexin A的黄体化颗粒细胞组的RNA,采用lllumina测序技术进行测序,利用生物信息学方法对转录组数据进行分析,在测序数据质量控制的基础上,对差异表达的基因进行筛选、功能注释和富集分析。结果表明,黄体化颗粒细胞组的孕酮分泌量显著高于未黄体化颗粒细胞组;转录组测序共获得了50个差异基因,其中上调表达20个,下调30个;发现多个与细胞周期调控、繁殖及代谢相关的高表达基因,如PRRT2、ID1、RRM2、ATP6、ATP8、KIRREL、SOX4、TBX3等基因,结合GO分析和KEGG通路分析表明,差异基因主要参与代谢途径、氧化磷酸化、癌症信号通路、GnRH信号通路、cGMP-PKG信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路以及Ca离子信号通路等。本试验为进一步阐明orexin A影响绵羊的生殖调控提供了依据。     

家蚕SoxE基因的全长cDNA克隆和表达谱分析

Sox基因家族是在动物中发现的一类重要的转录调控因子。基于生物信息学和RACE策略,从家蚕胚胎中克隆了一个与果蝇E族Sox基因成员同源的基因的全长cDNA,命名为BmSoxE(GenBank登录号:HQ728280)。BmSoxE的cDNA序列全长为1 398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白序列含有典型的HMG-box结构域和数个磷酸化位点。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕生殖腺中高量表达;时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,Bm-SoxE基因的表达维持在较高水平,暗示BmSoxE基因在家蚕性别决定和分化中可能发挥了调控作用。     

家蚕BmPP基因的克隆及在Bm-12细胞的表达

MD-2(related lipid recognition protein,ML蛋白质)是哺乳动物中一类重要的脂类识别蛋白,可以识别革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组分脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),二者形成复合体后被跨膜蛋白质受体TLR4(Toll like receptor 4)识别,进而启动下游免疫信号通路。在鳞翅目昆虫家蚕中,研究发现LPS可以诱导其体内抗菌肽的表达。为了研究家蚕中参与LPS识别的跨膜蛋白及信号通路,论文通过生物信息学分析家蚕基因组数据库中的MD-2类似基因,通过对其结构域分析,发现家蚕Bm PP具有与哺乳动物中的MD-2相似的保守结构域。同时抽提脂肪体RNA,通过RT-PCR获得Bm PP基因,将其克隆至p IEx-4载体上转染家蚕Bm12细胞,48 h后Western-blotting检测发现BmPP成功表达并分泌到细胞培养基中。研究结果将为进一步研究LPS诱导家蚕细胞发生免疫反应的通路研究提供材料。