草鱼呼肠孤病毒的研究进展

草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成,编码11种结构多肽。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶,在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以及预防治疗等方面的研究成果,提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性,初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/O细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5.抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为K链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应.选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫小鼠后腹水ELISA效价为1∶720 000;IFA和Western-blotting结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够特异性识别GCRV-HZ08病毒粒子.本实验制备的MAb具有良好的生物学特性,为GCRV流行株血清学检测方法的建立及VP4蛋白相关功能研究奠定了基础.     

草鱼呼肠孤病毒的致病机制及抗病毒新对策

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引发草鱼病毒性出血病,是危害性最大的草鱼病原体。该病毒基因组由11条双链RNA组成,共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。报告总结了呼肠孤病毒在基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞融合、细胞膜渗透、干扰素分泌、细胞分裂以及细胞压力小体等方面与宿主细胞相互作用的生物学研究进展;论述了蛋白酶抑制剂、RNA干扰(RNAi)机制、干扰素诱导素、GCRV干扰颗粒及小分子化合物等抗病毒策略的分子作用机制。报告预测基于中草药的免疫增强剂和口服化基因工程抗病毒疫苗将是最容易被市场化的两种绿色抗草鱼出血病药物。     

草鱼呼肠孤病毒减毒的研究

草鱼呼肠孤病毒GCHV－892野毒株在PSF细胞中连续传代时，于培养液中加入一定浓度的桉液，传至19代已达减毒目的。继代至29代，其减毒效果保持稳定；传至27代后不再加入桉液，传代至37代，其减毒效果仍保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好，免疫原性强。用该弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后，草鱼的成活率和免疫保护率均达100％。因而作者认为桉液是草鱼呼肠孤病毒的一种良好减毒剂。经桉液减毒的GCHAV－892是一株可应用于生产上制备弱毒疫苗的良好弱毒株。     

草鱼呼肠孤病毒JX-0902株的分离和鉴定

收集江西南昌地区患典型草鱼出血病的病鱼组织,进行超薄切片电镜观察,结果显示,在脾、肾样品中发现大量病毒颗粒,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)相似。取病鱼肌肉、内脏研磨,组织液经离心、过滤除菌后进行鱼体人工感染试验和细胞感染实验,结果发现,人工感染试验鱼出现死亡,且具有典型出血症状;组织滤液感染草鱼肾细胞系(CIK)细胞后,盲传6代未观察到典型细胞病变效应,但感染细胞固定后经超薄切片电镜观察,细胞质内有大量病毒存在,与病鱼组织切片观察到的病毒形态一致。SDS-PAGE结果进一步揭示,新分离病毒株(暂命名JX-0902)基因组由11条dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征,但基因组带型与GCRV 873株存在差异,而与HZ08株接近。根据GenBank上已提交的草鱼呼肠孤病毒S6序列(GQ896337)设计特异引物,以JX-0902株的cDNA作为模板,可扩增出特异性条带。基于S6序列的聚类分析结果显示,JX-0902与GCRV HZ08株、GD108株S6同源性高达98%、99%,该分离株应为草鱼呼肠孤病毒。     

草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白功能及免疫原性分析

在前期研究中分离到一株草鱼呼肠孤病毒,GCRV-GD108,并获得其全基因组序列.该病毒株的M5基因编码VP5蛋白,该蛋白与哺乳动物正呼肠孤病毒μ2蛋白具有较高的同源性及相似的NTPase结合保守区域,推测VP5蛋白也同样具有NTPase活性.为检测VP5蛋白是否具有NTPase活性及其是否具有免疫保护作用,采用已构建的原核表达载体表达VP5重组蛋白,通过孔雀绿钼酸铵法检测纯化后的重组蛋白的NTPase活性.采用DNAstar软件预测M5基因编码蛋白的抗原性,综合蛋白亲水性、表面可及性与表面抗原性三项指标,预测编码蛋白可形成抗原表位的氨基酸区域数多达86个,提示VP5蛋白具有较强的免疫原性.用重组蛋白VP5免疫健康草鱼,通过人工攻毒实验检测VP5蛋白的免疫保护作用.结果显示,VP5重组蛋白具有NTPase活性,且其NTPase活性依赖于Mg2+或Na+/K+,而Ca2+的存在可能抑制其活性;VP5蛋白可诱导草鱼产生高水平的抗体滴度,并显著提高IgM mRNA的表达水平,但未能为草鱼提供抗GCRV感染的保护.研究首次证实GCRV-GD108株VP5蛋白具有NTPase活性,但不能为草鱼提供免疫保护作用.     

草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定

2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8～10 cm的草鱼鱼种.5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡.将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞(CIK),连续接5代均出现明显的细胞病变(CPE),并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致.该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml.内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70～75 nm.理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性.经草鱼呼肠孤病毒特异性的RT-PCR检测,获得阳性的目的片段,测序的结果与草鱼呼肠孤病毒相应序列的同源性达99%以上.上述鉴定结果表明所分离的病毒为草鱼呼肠孤病毒,将其命名为HZ2008.     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株的分离与鉴定

从浙江省湖州地区采集发病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)样本中,取症状明显病料的肝、脾、肾组织,经过滤除菌处理后接种草鱼肾脏细胞(CIK).盲传8代,CIK细胞未出现明显细胞病变,但感染细胞固定后经电镜观察发现,细胞质内有大量病毒聚集,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)相似.将病毒提纯后分别经DNA酶、RNA酶和绿豆核酸酶消化,证实为双链RNA(dsRNA)病毒.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,病毒基因组由11个dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征.采用RNA水平3味端加接头的方法获得了S6节段的全长序列,测序结果表明,S6由2 030个核苷酸组成,推测其编码一个分子量约为68.4 kD的蛋白.聚类分析结果显示,该病毒为水生呼肠孤病毒,但在氨基酸水平上与草鱼呼肠孤病毒代表株873株的差异较大,同源性为33%,提示该病毒为一株新型的草鱼呼肠孤病毒.本研究旨在为草鱼出血病防治方法的深入研究奠定基础.     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。     

草鱼呼肠孤病毒GCRV VP56相互作用蛋白的鉴定

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建p GBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌株中检测其自激活性后,以VP56为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株,并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼JAM-A(Gc JAM-A)基因,并构建p GADT7-Gc JAM-A载体,在酵母中研究草鱼Gc JAM-A与病毒蛋白VP56相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒p GBKT7-VP56无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选;从草鱼肾细胞文库中筛选得到9株阳性克隆,基因测序及序列分析确定其中包含草鱼7个细胞内蛋白和1个细胞外基质蛋白;VP56蛋白与Gc JAM-A蛋白在酵母中不能发生相互作用。本研究初步确定了与Ⅱ型GCRV蛋白VP56存在潜在相互作用的宿主蛋白,为深入探讨VP56蛋白在Ⅱ型GCRV感染宿主过程中的生物学功能奠定了基础。     

草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发与应用

正随着水产养殖产业的不断扩大,我国已成为世界上最大的水产品生产消费和进出口国家。2000年至2013年,水产养殖产量以每年5%~6%稳步增长,在2013年,中国水产养殖产量达4.542×10~7t,占全球水产养殖总产量的60%以上~[1]。根据世界粮农组织数据显示,2015年我国水产养殖总量达7.430×107 t。这些数据表明我国水产养殖业不仅保障了中国水产品的市场供应,也对世界水产品供     

Quality Evaluation of Grass Carp (Ctenopharyngodon idella) Protein Concentrate Supplemented Noodles

ABSTRACT

The aim of the present study was to evaluate the quality of wheat flour noodles supplemented with 0%, 10%, 20% and 30% grass carp protein concentrate (GCPC). Proximate composition, color analyses, cooking properties (cooking time, cooking loss, swelling index and water absorption index), texture profile analyses (TPA), and sensory evaluations were performed. Significant (p ≤ 0.05) increases in the crude protein (18.94–35.19%), crude fat (0.88–1.06%), and ash (0.89–1.02%) were recorded for GCPC supplemented cooked noodles. Brightness (L*), redness (a*) and yellowness (b*) of GCPC 10–30% fortified cooked noodles was recorded as 77.00–69.97, 1.50–2.81 and 19.08–22.25, respectively. Cooking loss (CL) and optimal cooking time were significantly (p ≤ 0.05) increased with increased level of GCPC from 0%-30%, with readings of 6.13% ?8.90% and 7.53–11.77 min, respectively. Swelling and water absorption indices showed a decreasing trend at 2.33–1.77 and 102.6–78.49%, respectively. A significant (p ≤ 0.05) decreasing trend in hardness (24.50–19.03N) was observed for cooked noodles with increased level of GCPC, while the remaining TPA parameters were significantly different at p> .05. Sensory analyses showed higher preference for control noodles and noodles fortified with 10% GCPC.     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究

根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)特性和对鲤春病毒的敏感性

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用.本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法,对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SvCv)在该细胞中的增殖特性等进行了研究.结果显示,GCO细胞的最适生长温度为25℃,在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长,培养液中最适的胎牛血清浓度为10％.测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性,发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比,GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性.生长盐线、电镜观察和凋亡实验显示,SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变,引起GCO细胞系出现凋亡,并在细胞质中大量增殖.结果表明,GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究.GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃,这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离.     

饲料蛋白质、脂肪、碳水化合物水平对草鱼生长和组织营养成分组成的影响

采用蛋白质、脂肪、碳水化合物含量不同的７种颗粒饲料，饲养初始体重约１６ｇ的草鱼，经６０天后取样分析，发现草鱼相对生长率随饲料蛋白质添加量的升高而显著上升；高蛋白质饲料一定程度上升高全鱼和肌肉的粗蛋白含量，并显著增加肝胰脏脂质，主要是中性脂质的积累。全鱼、肌肉和肠－肠系膜脂肪含量随饲料脂肪添加量增加而显著升高。这表明，饲料蛋白质添加量是影响草鱼肝脏脂质积累的主要因素     

草鱼“四联”疫苗在草鱼池塘养殖生产中的应用

利用4口池塘,每公顷放养75～100g/尾的草鱼种31 612尾～36 486尾。其中2口池草鱼种放养时接种草鱼"四联"疫苗,另2口池设为对照。经6个月的饲养试验,结果表明:接种疫苗的试验池草鱼与未接种疫苗的对照池相比,发病率比对照池低10.7%,成活率与平均产量比对照池分别提高12.8%和20.8%。试验初步证明,接种草鱼四联疫苗能有效地增强草鱼对"四病"的抵御能力,提高草鱼养殖成活率,是有效防治草鱼"四病"的有效措施之一。     

Effects of Heat Treatment on the Antigenicity and Allergenicity of Grass Carp Muscles

ABSTRACT

Fish is one of the most common sources of food allergens, and grass carp is among the most popular freshwater fish. The objective of this study was to investigate the effects of heat treatment on the antigenicity and allergenicity of white and dark muscle of grass carp. The results showed that the antigenicity of heated white muscle was higher than that of unheated white muscle, while the allergenicity of white muscle was lower than that of unheated muscle when heated at 65°C, and the lowest value was 44.6%. Furthermore, the allergenicity of dark muscle increased for the first 30 min when heated at 65°C, and it increased for the first 60 min and then decreased with the increasing heating time thereafter when heated at 80 and 100°C. In addition, the lowest antigenicity and allergenicity of dark muscle were obtained at 100°C, and the values were 0.447 mg mL^?1 and 47.0%, respectively. Thus, to decrease the antigenicity and allergenicity of grass carp muscles, it is suggested that heating at 65°C is better than 80 or 100°C for the white muscle, while 100°C is an appropriate heating temperature for the dark muscle.     

噬菌蛭弧菌对草鱼池水质及细菌群落的影响

研究了噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)对草鱼池水质及细菌群落的影响.结果表明,噬菌蛭弧菌对养殖环境的主要水化指标具有明显的改善作用,试验组的平均COD、NH3-N、硫化物显著低于对照组(P<0.05),试验组的DO显著高于对照组(P<0.05),而试验组与对照组的pH值差异不显著(JP>0.05);池水细菌总数及致病菌的数量也随着噬菌蛭弧菌浓度的增加而发生儿何级数减少.