凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病致病菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察

为查明上海市奉贤区某对虾养殖场疑似患急性肝胰腺坏死病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的病原菌,本研究从患病凡纳滨对虾肝胰腺组织分离纯化到1株优势菌FHBX-1,并通过人工回归感染试验确定其致病性,利用VITEK-2全自动微生物鉴定仪和16S rRNA、热休克蛋白HSP60基因序列分析进行综合鉴定,并检测其毒力基因。同时采用K-B纸片扩散法检测病原菌的药物敏感性并通过石蜡切片观察患病凡纳滨对虾肝胰腺组织的病理特征。结果显示：菌株FHBX-1经生理生化特征测定、16S rRNA和热休克蛋白HSP60基因序列分析,综合鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）,且携带了急性肝胰腺坏死病相关的毒力基因pirA^VP、pirB^VP,未携带副溶血弧菌临床主要毒力基因耐热直接溶血毒素tdh和相对耐热直接溶血毒素trh基因。人工回归感染试验结果显示,凡纳滨对虾在菌液浓度为1.0×10⁶ CFU/mL浸泡感染试验组,7 d内累计死亡率为80%,患病凡纳滨对虾具有肝胰腺颜色变白、萎缩变小,胃肠变...     

凡纳滨对虾感染致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的定量分析

对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)携带的pVA1-like质粒所表达的PirAVp和PirBVp毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×105 CFU/ml VpAHPND分离株20130629002S01对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染,于感染后2~9 d采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织,采用实时荧光定量PCR方法,检测各组织中的pirAVp拷贝数。结果显示,感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到pirAVp,其中,肝胰腺在感染后第4天达到峰值, 为8.71×104 copies/mg,而鳃、肌肉、肠道分别在第3、4、5天达到峰值,分别为9.08×103、2.59×104、5.76×104 copies/mg。早期感染鳃组织中先出现VpAHPND的富集,在高死亡发生期,VpAHPND数量在肝胰腺和肠道出现高峰,在死亡数量逐渐下降的后期,各组织的VpAHPND均快速下降,肠道、肝胰腺和肌肉中的VpAHPND水平趋于接近。对虾肝胰腺组织病理切片显示,同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比,濒死对虾表现出更严重的AHPND病理特征,且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重,但检测到的VpAHPND数量呈下降趋势。研究表明,在VpAHPND感染过程中,组织中的pirAVp基因数量不能代表对虾的发病程度,发病程度及组织病理严重的AHPND样品中VpAHPND的数量不一定处于高水平状态。     

急性肝胰腺坏死病病原菌毒力的初步研究

近年来,致病性副溶血弧菌引起的急性肝胰腺坏死病的致死率较高,从病程上分为急性和亚急性两类。本试验选取来自江苏不同地区的引发急性、亚急性的6株致病性副溶血弧菌,通过攻毒试验验证其毒力强弱,并通过多位点序列分型进行菌株分型研究。攻毒试验结果显示,菌株SHY1669、SHY1776、SHY1777、SHY1833攻毒试验组的对虾死亡率显著高于菌株SHY1673、SHY1697(P<0.05)。利用多位点序列分型技术进行分型研究,菌株SHY1669、SHY1673、SHY1697、SHY1776、SHY1777、SHY1833分型结果为ST452、ST882、ST415、ST114、ST919、ST2355,其中ST2355为新序列型,其余均为已知序列型,且与ST1743同源性最高。系统发育树分析显示,急性与亚急性菌株在进化方面未表现出显著差异,急性菌株主要出现在亚洲地区,而亚急性菌株出现在北美洲和亚洲等地区。本研究结果表明,不同致病性副溶血弧菌在毒力方面存在强弱之分,但在多位点序列分型中未表现出亲缘关系的差异。     

副溶血弧菌对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性和基因表达的影响

为了研究致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对凡纳滨对虾(Litopanaeus vannamei)肝胰腺抗氧化酶活性及相关基因表达的影响,本研究选取始体重(2.20±0.24)g的健康凡纳滨对虾初270尾,将其随机分为2组,分别以0 CFU/m L和5×107 CFU/m L剂量的致病性副溶血弧菌对凡纳滨对虾进行浸浴攻毒实验。在实验第6小时、12小时、24小时和36小时取肝胰腺,进行抗氧化酶活性及免疫相关基因表达测定。结果显示,感染副溶血弧菌后,实验组对虾肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于对照组(P0.05),而过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)活性随感染时间的增加呈现先上升后下降的趋势,CAT活性于第12小时达到最大值,而GSH-PX和GST分别在第6小时和第24小时达到最大值,此结果表明副溶血弧菌感染对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性有显著影响,对其机体免疫防御系统有明显的破坏作用。Rab蛋白基因(Rab)和干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(Grim-19)表达水平显著高于对照组(P0.05),抗菌肽crustin和酚氧化酶原基因(Pro PO)的表达水平呈现先升高后降低趋势,分别在第12小时和第24小时达到最大值,分别为11.4倍和28.2倍,而GST基因表达水平在第12~36小时显著低于对照组(P0.05)。m TOR信号通路中真核细胞始动因子4E结合蛋白(4EBP)基因的表达水产显著高于对照组(P0.05),真核细胞翻译启动因子1(e IF4E1A)和真核细胞翻译启动因子2(e IF4E2)基因的表达水平呈现先升高后降低的趋势,分别在第12小时和第6小时达到最大值,分别为2.6倍和1.6倍,核糖体S6蛋白激酶基因(P70s6k)的表达水平显著低于对照组(P0.05)。上述结果表明,凡纳滨对虾感染致病性副溶血弧菌后,肝胰腺抗氧化酶活性及免疫相关基因的表达均受到显著影响。     

凡纳滨对虾发光病病原的分离鉴定及防治措施

从广东某虾苗场患病虾苗体内分离到一株致病菌(D-1),回归感染实验证实该菌为虾苗发光病的致病菌.经BIOLOG细菌自动鉴定系统鉴定,该菌与哈维氏弧菌相似度最高(0.718),可利用的唯一碳源有乙酸、D-葡萄糖酸、麦芽糖、吐温、糊精等40种;采用通用引物扩增出该菌的16S rRNA片段,并进行了序列分析,结果表明,该菌的16S rRNA序列与哈维氏弧菌同源性最高(99.84％),且在系统发育树上与其聚成一簇.药敏实验结果显示,在60种抗生素中菌株D-1仅对菌必治、复方新诺明、先锋必、亚胺培南、舒普深等12种药物敏感,对青霉素G、氨苄西林、米诺环素、米罗沙星等35种药物有抗性.防治实例表明,0.2mg/L的舒普深能治愈发光率在10％以内的患病虾苗,治疗成活率为80％～ 90％.     

凡纳滨对虾细菌性红体病病原的分子特征与耐药性

为探明引起凡纳滨对虾细菌性红体病的病原,从病虾肝胰脏分离得到10株优势菌,经回归感染实验证实其为引起此次红体病的病原菌.Vitek与16S rRNA序列分析显示,分离株均为副溶血弧菌.基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)表明,这些菌株形成3个新序列型(ST),其中1株为ST413,7株为ST414,2株为ST415;ST413包含新等位基因型recA-166与tnaA-121,ST414则含有新等位基因型gyrB-219.MLST结果提示,这些副溶血弧菌分离株并非来自单一克隆,呈现出一定水平的分子多样性.但这些菌株均含有大流行群(PG)的分子标记toxRS与VPA1168,并具有相同的毒力基因构成(tlh+ tdhtrh-T3SS1+T3SS2-)与耐药谱,其tdh与trh的缺失并未影响细菌对凡纳滨对虾的致病力.综上所述,引起此次凡纳滨对虾红体病的10株副溶血弧菌可能为PG的不同变异株.     

氨氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌的易感性

为探讨养殖水体中总氨氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)"急性肝胰腺坏死综合征(Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome,AHPNS)"发生的影响,设置了1个对照组和4个不同质量浓度氨氮实验组:2.5、5.0、7.5、10.0 mg/L实验组,胁迫20 d后腹肌注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行感染。凡纳滨对虾感染后6–24 h,除对照组外,各实验组均出现死亡高峰。24 h后,5.0、7.5和10 mg/L实验组对虾累积死亡率均高于2.5 mg/L组,且在同一取样时间各实验组对虾累积死亡率随着氨氮浓度的升高而升高,48 h后各实验组对虾不再死亡,其累计死亡率分别为0、8%、12%、20%和36%。PO活性呈现先升高再降低的趋势,对照组、2.5和5.0 mg/L实验组PO活性差异性不显著(P0.05),7.5和10 mg/L实验组除12 h外均显著低于对照组(P0.05)。SOD活性呈现先升高后下降的趋势,7.5和10 mg/L实验组SOD活性在感染后除24 h外均显著高于对照组(P0.05),而2.5 mg/L实验组与对照组差异性不显著(P0.05)。对照组和2.5 mg/L实验组对虾LSZ活性在各取样时间点差异性不显著(P0.05),7.5和10 mg/L实验组对虾LSZ活性在3 h、6 h、24 h、48 h时间点显著低于对照组(P0.05)。感染6 h后各实验组对虾肝胰腺中Lv LT m RNA表达量开始上升,24 h后开始下调,至72 h恢复至原水平。实验结果表明,氨氮胁迫能降低凡纳滨对虾的非特异性免疫酶活性,影响对虾肝胰腺中Lv LT m RNA对病原刺激的应答反应,增加对副溶血弧菌的易感性,为预防凡纳滨对虾AHPNS的暴发,养殖水体中总氨氮浓度应控制在1.96 mg/L以下。     

凡纳滨对虾中发光坎氏弧菌的分离、鉴定及致病性

为研究凡纳滨对虾死亡的致病机理,实验采用TCBS培养基从濒死凡纳滨对虾肝胰腺分离到浅绿色、直径3～7 mm的发荧光菌落;革兰氏染色为阴性短杆菌;经API 20E鉴定,分离株PvL-1与坎氏弧菌参考菌株CAIM249相似度为90％;fitZ序列与坎氏弧菌CP020076相似度为99.31％;gapA序列与坎氏弧菌EF59...     

引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌MLST新序列型

针对12株引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对12株AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。收集其他地区AHPND致病性副溶血弧菌的多位点序列分型(MLST)数据,采用eBURSTV3及MEGA5.0软件进行遗传进化分析。结果显示,2014年中国广东分离的AHPND致病株属于一个新序列型ST1710(42、134、99、79、141、41、51),仅与库中ST415及ST975同源性较高。目前,急性肝胰腺坏死致病株的9种ST型可归为2个克隆组和5个单体。经系统发育树进一步分析可知新序列型ST1710与单体ST975遗传关系相近。本研究首次报道中国AHPND分离株的序列型,丰富了PubMLST数据库,并为其遗传进化研究奠定了理论基础。     

几种消毒剂对凡纳滨对虾致病性弧菌的杀灭作用

本研究对分离的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)及Vibrio sp.Ex25共4株急性肝胰腺坏死病(AHPND)致病菌(编号分别为PV130903A、PV140731A、PV150526A和PV140821A)进行了杀灭作用实验,研究了聚六亚甲基胍(PHMG)、双氧水(H_2O_2)、聚维酮碘(PVPI)及二氧化氯(ClO_2)4种消毒剂对4株致病菌的杀灭浓度、杀灭时间及杀灭率的比较分析;同时追踪了PHMG在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖过程中对池塘水体弧菌的杀灭效果。结果显示,2μl/L的ClO_2作用1 h、1μl/L的PHMG或1μl/L的H_2O_2作用2 h、8μl/L的PVPI作用6 h可完全杀灭4种弧菌,PHMG和PVPI的杀菌率随时间的推移逐渐升高,H_2O_2和ClO_2的杀菌率在达到峰值之后均有不同程度的下降。在池塘养殖水体的弧菌杀灭实验中,浓度为0.5、1、2μl/L的PHMG可使养殖水体中的弧菌总量分别在第4天、第3天和第3天下降到最低值,分别为初始弧菌总数的79.14%、82.48%和87.30%;各浓度实验组弧菌总量达到最低值后逐步升高,直到第11天时上述各浓度实验组的弧菌总量仍然低于消毒前初始值的3.58%、5.53%和6.10%。综合比较分析,这4种消毒剂对致病性弧菌的杀菌能力强弱为:PHMGH_2O_2ClO_2PVPI。结合消毒剂的杀菌浓度、杀菌效果、持续时间以及使用成本等几个方面考虑,认为PHMG具有高效、持久等优点,在水产养殖中将会有良好的应用前景。     

4株凡纳滨对虾肠道益生菌分离、鉴定及应用研究

为将凡纳滨对虾肠道分离的益生菌用于对虾的养殖,利用乳酸菌培养基分离对虾肠道中的益生菌并对菌株进行初步分类鉴定,利用体外抑菌方法筛选有抗菌活性的菌株,用于考察对虾实验室养殖过程中抗有关致病菌的效果。试验结果显示,自虾肠道分离得到W7、W25、W27、W31菌株,分别属于啤酒酵母、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌沙漠亚种和暹罗芽孢杆菌,它们对致病菌副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有一定的抗菌活性,其中暹罗芽孢杆菌W31抗菌效果最好。将啤酒酵母W7和暹罗芽孢杆菌W31菌体与饲料混合用于对虾的养殖,能够明显增强凡纳滨对虾抵抗弧菌侵染的能力,提高存活率。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星多重PCR体系的建立及其在家系亲权鉴定中的应用

为了在遗传分析研究中提高效率并节约成本,本研究从已报道的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星位点中选取多态性较高的位点,基于各位点的扩增片段大小及退火温度等因素进行微卫星位点的组合.通过不断优化位点组合、反应体系及反应程序,成功建立了1个五重、2个四重和1个三重PCR反应体系,并将其应用于11个凡纳滨对虾家系的亲权鉴定.结果显示,四组多重PCR体系中的16个微卫星位点在11个凡纳滨对虾家系中的平均等位基因数(Na)为6,平均多态信息含量(PIC)为0.5813,平均观测杂合度(Ho)为0.513,平均期望杂合度(He)为0.636.利用Cervus3.0软件,对已知系谱关系的11个凡纳滨对虾家系进行亲权分析,其第一亲本累积排除率(CE-1P)、第二亲本累积排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)分别为0.99525487、0.99990862和0.99999986.进一步分析表明,当同时使用四组多重PCR体系进行亲权分析时,其模拟配对率和亲权鉴定准确率均为100％,全同胞和半同胞家系鉴别效果良好,表现出准确的鉴别能力.本研究所建立的四组凡纳滨对虾微卫星多重PCR体系均可为后续的凡纳滨对虾遗传多样性分析和亲权鉴定提供高效、准确的检测手段.     

凡纳滨对虾饲料添加剂的研究进展

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾,是目前世界养殖产量最高的三大虾种之一,具有对水环境抗逆能力强、营养要求低、生长速度快,虾体含肉量大、肉质鲜美、营养丰富等诸多优点,自1998年来,在广东、广西、海南等省(区)广为     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化养殖系统微藻的群落特征分析

2015年6-9月期间,对青岛市宝荣水产科技有限公司凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化养殖车间的6个实验池进行采样调查,分析了水体中微藻的种类组成、丰度、多样性和优势种演替特征,并结合养殖情况进行了讨论.共检出微藻5门28属49种(其中优势种14种),丰度范围为5.2×105-9.4×108 cell/L,生物量范围为1.23-208.00 mg/L,多样性指数范围为0.42-2.44.多样性指数低于0.9时,生态系统稳定性差,对虾易发病.不同养殖阶段微藻优势种种类不同,前期主要是绿藻门(Chlorophyta)、硅藻门(Bacillarionphyta)和部分甲藻门(Pyrrophyta)的种类,中、后期以蓝藻门(Cyanophyta)的微囊藻(Microcystis sp.)和颤藻(Oscillatoria sp.)为主.对虾养殖密度显著影响微藻优势种演替,300 ind/m2养殖密度(A1池)藻相稳定且以绿藻和硅藻为优势种,对虾生长良好;400-500 ind/m2养殖密度(B1、C1和C2池)颤藻在中、后期演替成为绝对优势种,对虾易发病死亡.本研究为优化对虾工厂化养殖环境、指导养殖生产提供参考.     

亚硝酸氮胁迫下噬菌体防治凡纳滨对虾弧菌病

在养殖水体不同亚硝酸氮的条件下,通过对凡纳滨对虾的毒性试验和检测对虾部分免疫指标的变化来研究副溶血弧菌噬菌体对对虾弧菌病的防治效果.试验设置0.005(对照)、0.75、1.50 mg/L和3.00 mg/L 4个不同亚硝酸氮的质量浓度作为胁迫组,并在此基础上加入副溶血弧菌设置为胁迫感染组,加入副溶血弧菌和噬菌体设置为...     

内陆地区南美白对虾苗种淡化试验

在内陆地区利用工厂化设施、臭氧水处理系统进行南美白对虾苗种淡化。淡化周期为12~15d,苗种成活率为65%~85%,单位水体出苗量5.0×104~7.0×104尾/m3。每个育苗季节可淡化虾苗4.0×107~5.0×107尾,卤水使用量仅为30 m3,并且无药物投放。     

凡纳滨对虾白便综合征的组织病理学观察

本文比较观察了不同规格的健康和患白便综合征凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肝胰腺、中肠、后肠、后盲囊等的组织结构。组织病理显示:白便综合征凡纳滨对虾肠道严重病变,肠腔空,环肌两侧增生大量成纤维细胞,这些增生细胞取代了肠上皮,而不见正常柱状上皮细胞;肝胰腺有不同程度和性质的病变,如腺管萎缩、崩解、坏死等。凡纳滨对虾患白便综合征的组织病变演变过程为:最初肠上皮基膜下出现一圈增生细胞,肠上皮柱状细胞脱离基膜;增生细胞持续增生增多,肠上皮崩解脱落至肠腔,增生细胞完全取代肠上皮;增生细胞不断增生,增生细胞层逐渐变厚,随着时间的推移,增生细胞层近腔端的一圈增生细胞坏死,出现一圈棕黄色物质,最终坏死细胞连同棕黄色物质脱落至肠腔。脱落至肠腔的腺管细胞、上皮细胞、增生细胞排出体外即为肉眼可见的白便。