胰腺癌细胞株Runx3基因启动子区CpG岛甲基化的检测

目的 探讨胰腺癌细胞株中Runx3基因启动子区CpG岛的甲基化水平.方法 应用甲基化特异性PCR方法检测Panc -1、BxPC-3、AsPC-1三种胰腺癌细胞株及正常胰腺组织RunX3基因启动子区CpG岛甲基化水平.结果 在Panc-1、BxPC-3、AsPC-1细胞株中Runx3基因启动子区CpG岛的甲基化引物均发...     

猪肌肉组织中ApoE基因5′调控区甲基化的研究

【目的】研究猪肌肉组织中猪载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因5′调控区的DNA甲基化状况。【方法】以180日龄长白母猪为试验动物,采集其肌肉组织,提取其DNA,经亚硫酸氢盐修饰后用作PCR反应模板;通过生物信息学预测猪ApoE5′调控区潜在的CpG岛,根据预测结果选用甲基化特异性引物对CpG岛进行PCR扩增,对回收、纯化的PCR产物进行克隆和测序,并与GenBank中的ApoE5′调控区序列进行比对,分析CpG岛的甲基化水平。【结果】生物信息学预测发现,猪ApoE基因5′调控区有2个CpG岛,第1个CpG岛有10个CpG位点,第2个CpG岛有12个CpG位点;PCR扩增获得长度分别为233bp的CpG岛1和288bp的CpG岛2序列,这2个CpG岛均存在着9个甲基化CpG位点。【结论】猪ApoE基因5′调控区是CpG位点的富集区域,2个CpG岛存在不同程度的甲基化。     

猪血液和肌肉组织DNA甲基化含量的测定

 摘要: 【目的】通过测定纯种亲本大白猪、长白猪、梅山猪及其正反交大白猪×长白猪、长白猪×大白猪、大白猪×梅山猪和梅山猪×大白猪等杂种猪血液和肌肉组织DNA甲基化含量，分别比较基于不同杂交组合和不同组织，亲本与子代之间在DNA甲基化含量上的差异,为揭示杂种优势的分子机制提供依据。【方法】采用高效液相色谱法测定血液和组织中甲基化含量。【结果】经过测定及计算，163份肌肉组织样平均甲基化含量为16.92%；182份血液样平均甲基化含量为6.49%，两者之间差异达到了极显著水平（p<0.01）。在相同组织不同杂交组合中杂种后代表现不同。同样地，在相同杂交组合不同组织之间杂种后代表现也不尽相同。【结论】杂种甲基化含量升高，可能是利用甲基化关闭了一些影响生长的不利基因的表达。杂种甲基化含量的变化表现为杂交组合和组织特异性。     

NCOA2核心启动子甲基化分析及其与肾周和皮下脂肪组织差异表达的关系

为探讨核受体辅激活蛋白2(NCOA2)基因启动子区甲基化水平与其在肾周脂肪组织及皮下脂肪组织中差异表达的相关性,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测NCOA2基因在肾周脂肪组织和皮下脂肪组织中的表达水平;通过构建系列NCOA2基因5'侧翼区缺失表达载体,并采用双荧光素酶报告系统鉴定NCOA2基因核心启动子区;在分析核心启动子区CpG岛的基础上,采用亚硫酸氢盐测序(BSP)法测定NCOA2基因核心启动子区CpG岛甲基化水平。结果表明:肾周脂肪组织中NCOA2基因的mRNA表达水平显著低于皮下脂肪组织;NCOA2基因核心启动子区位于-483~-179 bp;预测发现该区域存在1个CpG岛,BSP法表明该区域内的25个CpG位点在皮下和肾周脂肪组织均为非甲基化状态,无明显组织差异性。结论:肾周脂肪组织和皮下脂肪组织中NCOA2基因表达存在显著差异,而核心启动子区甲基化状态没有参与差异调控。     

奶牛COL1A2基因启动子区甲基化与其基因表达及乳腺炎的相关性分析

本研究分析奶牛健康乳腺组织和金黄色葡萄球菌感染的乳房炎乳腺组织中胶原蛋白Ⅰ型α2链基因(COL1A2)启动子区CpG岛甲基化与COL1A2基因表达的调控关系,为奶牛乳房炎的抗性育种及预防提供理论依据。利用生物信息学,分析COL1A2基因启动子区CpG岛分布及其转录因子结合位点;运用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)和RT-PCR法,分析健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中,COL1A2基因启动子区的CpG岛甲基化程度与COL1A2基因表达及乳房炎的相关性。结果表明健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中CpG岛甲基化差异不显著(P0.05),均呈低甲基化状态(50%),但位于转录因子SP1结合区域内的第4和第5 CpG位点,健康组甲基化程度(30%和60%)显著高于患乳房炎组(0和10%);健康组基因表达水平显著低于患乳房炎组(P0.05)。说明,COL1A2基因在不同乳腺组织中的差异表达可能与其启动子区CpG岛转录因子SP1结合区域内的第4和第5CpG位点甲基化程度差异相关。     

胃癌SOCS-1基因异常甲基化及其意义

目的：探讨SOCS-1基因在胃癌和癌旁组织中的表达及其启动子甲基化状态与胃癌发生、发展和转移等的关系。方法：采集45例胃癌病人的肿瘤标本、18例癌旁胃粘膜组织以及10例正常胃粘膜组织,运用甲基化特异性PCR反应研究胃癌组织中SOCS-1基因CpG岛甲基化状态,同时运用实时定量PCR分析SOCS-1基因的表达。结果：45例胃癌标本中有21例（46．7％）SOCS-1基因呈CpG岛甲基化,癌旁组织中为2例（11．1％）,而10例正常胃粘膜组织中则未发现SOCS-1基因CpG岛甲基化;SOCS-1基因CpG岛甲基化组的SOCS-1基因表达量与无SOCS-1基因CpG岛甲基化组相比,其基因相对表达量明显减少（P〈0．05）,表明SOCS-1基因CpG岛甲基化可抑制SOCS-1基因表达。与病人临床病理特征相结合比较,发现SOCS-1基因CpG岛甲基化与年龄、性别无关,与肿瘤分化程度及TNM分期等因素有关。结论：在胃癌中存在SOCS-1基因CpG岛甲基化,且由于CpG岛甲基化而促使基因表达抑制。SOCS-1基因CpG岛甲基化在胃癌的发生、发展中可能具有一定的意义。     

鸭骨骼肌TNNI1基因CpG岛区甲基化与mRNA差异表达

本研究旨在通过克隆鸭慢速骨骼肌型肌钙蛋白I 1(Slow skeletal muscle troponin I 1,TNNI1)基因5'侧翼区序列,检测鸭骨骼肌组织TNNI1基因的mRNA表达水平和启动子CpG岛区甲基化状态,初步探索TNNI1基因转录调控机制。采用染色体步移方法克隆测序获得鸭TNNI1基因5'侧翼区序列,进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测鸭胸肌和腿肌TNNI1基因mRNA表达水平,采用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测核心启动子区CpG岛在鸭肌肉组织中的甲基化水平。结果表明,克隆获得鸭TNNI1基因5'侧翼区序列2 078 bp,预测存在2个CpG岛,其中CpG岛(-2 032～-1 833 bp)位于预测的核心启动子区内,并存在多个真核生物结构元件和转录因子结合位点;甲基化检测发现,其总体甲基化水平在胸肌和腿肌组织中分别为52. 66%、57. 04%,差异不显著(P0. 05);荧光定量检测结果表明,鸭胸肌和腿肌TNNI1基因表达量差异显著(P0. 05);相关性分析结果表明,CpG4位点甲基化程度与胸肌TNNI1基因表达量呈极显著负相关(P0. 01)。鸭胸肌和腿肌TNNI1基因的mRNA表达量存在显著差异,其总体甲基化水平无显著差异。在胸肌中,启动子区CpG4位点可能通过甲基化修饰影响TNNI1基因的转录调控。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

猪MYOG基因遗传多态性与胴体及肉质性状的相关性

通过测定约180日龄的8个群体(梅山、大白、长白、大白×梅山F1代、梅山×大白F1代、长白×大白F1代、大白×长白F1代以及大白×梅山F2代)459头猪胴体性状、肉质性状以及肌细胞生成素基因(MYOG)多态性,分析MYOG在猪群体中的遗传效应。结果表明：MYOG在猪群体中呈现3种基因型,即AA、AB、BB;群体瘦肉率的提高与BB基因型显著相关,相较于AA与AB基因型,其提高幅度分别为3.57%和3.28%;在大白×梅山F2代群体中,MYOG的基因型与背最长肌pH值、股二头肌pH值呈显著相关;在大白×梅山F1代群体中,MYOG基因型与股二头肌大理石纹MM2呈显著相关。     

西藏小型猪IGFBP-3基因甲基化与表达差异分析

为研究西藏小型猪类胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)基因甲基化及表达差异,对IGFBP-3基因的CpG岛甲基化程度、mRNA及蛋白表达水平进行分析,并以军牧一号猪为对照。结果表明:西藏小型猪肝脏组织中IGFBP-3基因CpG岛甲基化水平显著高于军牧一号猪(P<0.05);西藏小型猪不同组织中IGFBP-3mRNA表达量均显著高于军牧一号猪(P<0.05);同时肾脏中IGFBP-3蛋白含量显著高于军牧一号猪(P<0.05)。这为猪生长发育调控及促生长机制提供了分子依据。     

猪印记基因MKRN3的SNPs筛选及胴体性状关联分析

以梅山猪、大白猪和长白猪为研究对象,筛选出MRKN3基因的单核苷酸多态位点(SNPs)并进行PCR-RFLP验证,利用PCR-Bst UI-RFLP对大白×梅山F2代资源家系(285头)DNA样品酶切分型,将分型结果与猪胴体性状进行关联分析。结果表明:猪MRKN3基因编码区有7个SNPs,分别为293CG、361GA、497GA、630GA、678TC、1376CT、和1407TA;其中678TC位点等位基因频率在中外不同猪种中存在差异;猪MRKN3基因678TC位点与内脂率及臀部膘厚显著相关(P0.05);678TC位点对内脂率具有显性效应(P0.05),表现为该位点杂合子比纯合子具有更高的内脂率;而该位点对臀部膘厚具有加性效应(P0.05),表现为等位基因678C的累加具有降低臀部膘厚的效应。因此,猪MKRN3基因的678TC位点可为猪的分子育种实践提供一定指导作用。     

结肠癌细胞系LHX6基因启动子甲基化检测与分析

为探讨结肠癌细胞SW480和HT-29中LHX6基因启动子区CpG岛的甲基化状态,分析去甲基化与结肠癌细胞增殖的关系,用甲基化特异性PCR对SW480和HT-29细胞的LHX6基因启动子区域CpG岛进行检测,对比经5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理后两株细胞该区域甲基化水平之间的差异,用(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝)(MTT)法检测5-Aza-CdR对其增殖的影响,观察5-Aza-CdR对细胞形态的影响.结果表明,SW480与HT-29细胞的LHX6基因启动子区域CpG岛均存在甲基化,分别为41.9％和28.6％;经5-Aza-CdR处理后,SW480甲基化率由41.4％降低到39.7％,HT-29甲基化率由27.4％降低至18.5％(p＜0.05);两株细胞的增殖明显被抑制.结肠癌细胞系SW480和HT-29的LHX6基因均存在不同程度的甲基化,研究结果为LHX6可能作为结肠癌肿瘤检测的新分子靶标奠定基础.     

鸡NLRC5启动子区转录调控序列的初步研究

为了探讨NLRC5启动子的潜在调控机制,将NLRC5基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体,构建重组质粒,并转染DF1细胞系。通过双荧光素酶实验寻找核心调控区,然后用目标捕获测序检测27个鸡品种的NLRC5核心启动子区的SNPs,并利用TRANSFAC,JASPAR和Meth Primer预测该区域的转录因子结合位点和CpG岛。结果显示,NLRC5启动子有2个核心区域,分别是1—617和1448—2108。第一个核心区域内存在3个SNPs,其中SNP1影响转录因子Hic1的结合序列,但SNPs对CpG岛不产生影响,表明NLRC5基因的启动子区的调控可能受不同因素的影响,但SNPs并不在甲基化的水平上影响启动子的活性。     

江口萝卜猪UCP2基因启动子变异分析

[目的]研究江口萝卜猪UCP2基因启动子变异,并对其进行生物信息学分析,为江口萝卜猪品种选育及开发利用提供理论依据.[方法]利用江口萝卜猪基因组DNA构建混合DNA池,PCR产物直接测序后采用DNASTAR等生物软件分析筛选出SNP位点,然后采用Neural Network Promoter Prediction、TFsitescan、WebGene等生物信息学分析软件预测单核苷酸突变前后的UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点和CpG岛.[结果]在江口萝卜猪UCP2基因启动子上共筛选到3个SNPs位点,分别是G-84>A、G-161>C和T-366>A.利用生物信息学分析软件分析单核苷酸突变对UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点及CpG岛的影响,结果发现,从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到的3个SNPs位点均不在预测到的启动子核心区域,但靠近转录起始点;3个SNPs位点也不在预测得到的CpG岛内,且不会影响UCP2基因启动子的甲基化水平;3个SNPs位点能在不同程度上导致转录因子结合位点消失或产生新的转录因子结合位点,其中G-161>C突变对转录因子结合位点的影响最大.[结论]从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到3个SNPs位点,分别为G-84>A、G-161>C和T-366>A,虽然这3个SNPs位点均不在启动子核心区域及CpG岛内,但不同程度造成转录因子结合位点消失或产生,其中G-161>C的影响最大,可能是调控UCP2基因表达的重要功能突变位点.     

性成熟前猪睾丸组织中印记基因DNA甲基化状态分析

为探求性成熟前猪睾丸中印记基因DNA甲基化状态,以1、2、3月龄三元杂交猪睾丸实质组织为材料,在利用Me DIP-seq(甲基化DNA免疫沉淀测序技术)建立性成熟前猪睾丸全基因组DNA甲基化图谱的基础上,比对得到了8个已证实的猪印记基因甲基化状态。结果显示,8个印记基因DIRAS3、IGF2、IGF2R、MEST、NAP1L5、NNAT、PEG10、PLAGL1,在性成熟前猪睾丸组织中的甲基化水平均不高,表现为"非甲基化"或"部分甲基化";NNAT、PLAGL1启动子甲基化水平在1~3月龄间保持增长,NAP1L5、IGF2R启动子甲基化水平在1~2月龄下降,2~3月龄增长,DIRAS3、IGF2、MEST、PEG10 promoter甲基化水平在1~2月龄增长,2~3月龄下降;图谱中仅比对到4个基因的gene body甲基化状态,IGF2R、MEST gene body甲基化水平在1~3月龄保持下降,PLAGL1、PEG10 gene body甲基化水平在1~2月龄增长,2~3月龄下降。推测这8个印记基因在性成熟前猪睾丸发育过程中均具有一定活性,且DNA甲基化对印记基因发挥一定的调控作用。     

猪LPAR3基因克隆及其在子宫内膜细胞的表达

【目的】获得猪LPAR3基因完整mRNA及基因结构,研究其启动子活性;探究LPAR3基因在子宫内膜的转录调控及可能影响母猪产仔的机制。【方法】应用5'RACE和3'RACE技术获取LPAR3基因完整mRNA序列;预测5'调控区潜在的启动子转录因子结合位点及CpG岛,构建不同长度的启动子双荧光素酶报告基因重组载体,与pRL-TK质粒共同转染至猪子宫内膜细胞,检测启动子活性;应用RT-qPCR比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的相对表达量;应用亚硫酸氢钠修饰后测序比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的甲基化状态。【结果】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,其中5'UTR和3'UTR的长度分别为202和860 bp,CDS区为1 065 bp。克隆获得包括LPAR3转录起始位点上游3 080 bp (–2 430/+650bp)的5'调控序列,分析预测显示该调控区不存在TATA box,存在GC元件、CPBP及糖皮质激素受体IR3等调控因子结合位点,且在–190/–84和–44/+651 bp处存在2个潜在CpG岛。成功构建9个不同长度的5'缺失报告重组载体并转染猪子宫内膜细胞。双荧光素酶活性检测结果显示,启动子P4(+454/+80 bp)的转录活性最高,其次是P6(–123/+80 bp)。RT-qPCR结果显示,妊娠第12天二花脸猪LPAR3基因在子宫内膜的表达量高于在其他组织的表达量,且极显著高于在妊娠第12天长大二元猪子宫内膜的表达量,LPAR3在2个猪种子宫内膜均处于低甲基化状态且差异不显著。【结论】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,妊娠第12天LAPR3基因在二花脸猪子宫内膜表达高于其在长大二元猪子宫内膜的表达,显示LPAR3可能参与了猪早期妊娠并影响产仔数。     

FSH和LH及其受体基因在梅山猪公猪HPT轴的表达

为了研究卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)及其受体在梅山猪公猪各组织中的表达特征以及在下丘脑-腺垂体-性腺轴(HPT轴)中的表达规律,采用荧光定量PCR(RT-PCR)方法对6头150日龄梅山猪公猪的生殖组织、脑组织及内脏组织中FSHβ、FSHR、LHβ和LHR基因的表达情况进行分析。结果显示,FSHβ基因在梅山猪公猪的下丘脑和垂体中表达;FSHR基因在梅山猪公猪的睾丸、附体、附尾和尿道球腺中表达;LHβ基因在梅山猪公猪的睾丸、附头、附体、垂体、大脑、小脑和海马中表达;LHR基因在梅山猪公猪的睾丸和下丘脑中表达。采用荧光定量方法对各日龄(2、30、60、90及150日龄)梅山猪公猪下丘脑、垂体和睾丸中FSH和LH及其受体的表达进行研究。结果表明,FSHβ在下丘脑和垂体中的表达量随日龄的增加而增加;FSHR在睾丸中的表达量在2、30、60日龄段中较稳定,90日龄时表达量开始降低,150日龄的表达量达到最低值;LHβ在垂体中的表达、LHR在下丘脑中的表达和LHR在睾丸组织中的表达趋势都呈现起伏状态,30日龄时出现表达高峰,60日龄时表达量降低,90日龄时又达到表达高峰,以后降低;LHβ在睾丸中的表达量在2、30、60日龄段无显著差异(P0.05),90日龄时达到表达最高峰,150日龄时表达量有所降低。     

猪NCOA3启动子甲基化对其在肌内和皮下脂肪组织差异表达的影响

[目的]以新淮猪肌内脂肪和皮下脂肪为试验材料,探讨核受体辅激活蛋白3(NCOA3)启动子甲基化对其在肌内与皮下脂肪组织中差异表达的影响。[方法]采用RT-PCR的方法检测NCOA3在肌内脂肪与皮下脂肪组织的表达水平。构建NCOA3启动子缺失报告载体,并采用双荧光报告基因系统分析启动子区域活性。预测NCOA3启动子区Cp G岛,利用亚硫酸氢盐法(BSP)检测2种脂肪组织NCOA3启动子区Cp G岛甲基化水平,并通过甲基转移酶处理,以检测甲基化对NCOA3基因启动子活性的影响。[结果]NCOA3 mRNA在肌内脂肪组织中表达水平极显著低于皮下脂肪组织(P0.01),其中-150~-3 bp区域启动子活性最高,Cp G岛位于-930~-699 bp,且其整体甲基化水平在肌内脂肪与皮下脂肪组织中差异不显著(P0.05),分别为90.0%,83.5%,但-904位点CG甲基化水平差异显著(P0.05)。经甲基转移酶处理p LUC-1057(包含Cp G岛)载体荧光活性显著下降(P0.05)。[结论]NCOA3基因在肌内脂肪与皮下脂肪组织存在着表达差异,-904位点CG甲基化水平对肌内与皮下脂肪组织表达差异存在影响。     

母鸡叶酸缺乏对子代MTHFD2和TYMS基因甲基化和表达水平的影响

为探究母鸡叶酸缺乏对子代与叶酸代谢相关的MTHFD2和TYMS基因甲基化模式和基因表达水平的影响,利用亚硫酸盐测序和定量PCR方法进行测定。结果表明:1)亲代叶酸缺乏对子代MTHFD2基因启动子区甲基化没有影响,该基因启动子区16个CpG位点不存在甲基化;2)子代TYMS基因ATG下游8个CpG位点甲基化主要发生在第2、3、4和5位点,但这4个CpG位点的甲基化比率在对照组和叶酸缺乏组之间均未达到差异显著水平(P0.05);并且TYMS总体甲基化水平在对照组和叶酸缺乏组之间差异也不显著(P0.05);3)母鸡叶酸缺乏可引起子代肝脏组织MTHFD2和TYMS基因表达水平均显著增加(P0.05)。综上所述,亲代叶酸缺乏对子代MTHFD2和TYMS基因表达水平发生作用,但未对基因甲基化比率造成影响,表明DNA甲基化模式由多个因素决定,可能存在叶酸以外的其他调控机制。     

湖北白猪杂交后代MyoG基因型对部分生产性状的影响

采用PCR-RFLP(MspⅠ)方法分析了湖北白猪杂交后代共计228头猪的MyoG基因外显子2、3及内含子2和5′-端调控区域遗传多态性,利用最小二乘模型分析了杂交后代MyoG基因型对相关生产性能的影响。结果表明:在PCR1MspⅠ-RFLP位点上,杂交后代的优势基因型为AA型,没有发现纯合BB型;在PCR2MspⅠ-RFLP位点上,杂交后代表现为单态,没有发现梅山猪特异性MspⅠ多态性酶切位点;不同基因型间个体初生重、20日龄重、日增重、瘦肉率、肌内脂肪含量等生产性能差异不显著。