猪β干扰素基因的修饰及其蛋白活性的检测

为获得高效表达的重组猪β干扰素,在保留编码蛋白序列的同时,对PoIFN-β基因进行毕赤酵母偏嗜性改造,使基因序列G+C的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA.构建了酵母表达裁体pPICZαC-PIB.pPICZαC-PIB经Sac Ⅰ酶切线性化后电转导入毕赤酵母菌株X-33.对PCR鉴定为阳性的酵母菌株进行高抗性筛选,获得1株高效表达PoIFN-β酵母菌株,其表达量约258.3 mg/L,是未经密码子改造菌株表达产物的3.4倍.经SDS-PAGE和Western blotting检测,表达产物为相时分子质量约22 000和24 000的蛋白,两者均可与抗PoIFN-β阳性血清发生特异反应.将表达产物进行氨基酸测序,测得2段随机肽段与PoIFN-β的氨基酸序列完全一致.在VSV-Vero系统上检测重组PoIFN-β对水泡性口炎病毒在Vero细胞中增殖的抑制作用,其抗病毒活性为1.88×106IU/L,是未经密码子改造菌株表达产物抗病毒活性的5.6倍.用MTT法检测PoIFN-β对猪外周血淋巴细胞成熟的影响,结果表明.猪重组PoIFN-β能有效刺激淋巴细胞转化,具有良好的免疫学活性.     

猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot印迹杂交结果证实,表达产物为重组PoIFN-α融合蛋白,经细胞毒性试验检测(WISH/VSV系统),表达产物的抗病毒活性为4.1×104IU/mL。     

共表达MEL和Ec-cLYZ重组表达质粒的构建及其重组蛋白的抑菌效果评价

为了表达一种高效低毒的广谱抑菌蛋白，试验通过T2A连接肽连接蜂毒肽(MEL)与斜带石斑鱼c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因，并克隆至pPICZαA质粒上构建重组表达质粒；将鉴定正确的重组表达质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化后电转化至毕赤酵母表达菌株GS115感受态细胞中，构建毕赤酵母表达菌株；利用0.5%甲醇诱导表达，收集上清液进行冻干浓缩并纯化，采用Western-blot法检测重组蛋白的表达情况，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度，试管二倍稀释法分别检测不同浓度重组蛋白对兔红细胞的溶血活性，牛津杯法评价重组蛋白的抑菌效果。结果表明：成功构建出重组表达质粒pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、pPICZαA-Ec-cLYZ和pPICZαA-MEL及毕赤酵母表达菌株GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL、GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ和GS115/pPICZαA-MEL;经甲醇诱导，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ-MEL表达出分子质量为16.5,3.4 ku的重组蛋白，GS115/pPICZαA-Ec-cLYZ表达出分子质量为16.5 ku的重...     

重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价

试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10~7 IU/mL,比活性为1.58×10~7 IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

荣昌猪IFN-ω基因毕赤酵母表达载体的构建与表达

将荣昌猪IFN-ω基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后,氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,通过酶切、PCR鉴定表明成功构建了表达荣昌猪IFN-ω基因的酵母基因工程菌。经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测,表明荣昌猪IFN-ω基因在毕赤酵母中实现了高效表达。表达产物在MDBK细胞上抗VSV的比活性为1.21×106U/mg,表明具有抗病毒活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与ORFs3～7基因特性研究

应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用EcoRI和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAS1。用BstXI酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒S1蛋白基因在毕赤酵母中的表达

应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用Ec0R I和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαASI。用BstX I酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1％甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。     

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性，利用pET-32a载体系统，构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外，MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性，并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性，同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平；之后通过小鼠攻毒保护试验，测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量，ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化，并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示，成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10⁶ IU,对细胞没有损害作用，且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平；在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖，减少促炎因子的产生，延缓临床症状的出现。结果表明，原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性，为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。     

猪Ⅰ型干扰素融合表达及其抗病毒活性检测

采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将猪I型干扰素PoIFN-α和PoIFN-β成熟肽基因进行连接,构建表达载体pET30a-PoIFN-α/β进行融合表达,利用细胞病变抑制试验检测融合干扰素rPoIFN-α/β抗病毒活性,并与非融合干扰素rPoIFN-α和rPoIFN-β进行比较分析。结果表明,在PK-15细胞上,融合干扰素rPoIFN-α/β表现出较强的抗病毒活性,其对VSV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PASTV、PEDV和TGEV的抗病毒活性明显高于非融合干扰素,体现了一定的叠加效应,可以用于猪病毒性疾病的防治。     

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板，扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫（Eimeria acervulina）广东株3-1E基因（长度为529bp），将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中，构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母，甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测，表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

禽腺病毒血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白在毕赤酵母中的优化表达

【目的】在毕赤酵母中构建禽腺病毒(FAdV)血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白表达系统,并探索适宜的表达条件。【方法】以前期构建的重组质粒pCold-Fiber2-Fiber为模板,用PCR法扩增Fiber2-Fiber片段,连接pPICZαA载体。经双酶切和测序鉴定后的阳性重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber电转化毕赤酵母GS115。经MD平板和不同浓度Zeocin抗性筛选后进行PCR扩增和测序鉴定得到阳性菌株;用甲醇诱导表达阳性菌株,72 h后收集蛋白上清进行SDS-PAGE和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定。采用单因素变量法对不同pH(5.0、6.0、7.0和8.0)、甲醇浓度(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)、时间(24、48、72和96 h)进行表达条件优化,用SDS-PAGE鉴定,并用间接ELISA和Western blotting验证重组蛋白的反应原性。【结果】成功构建了重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber,对表达72 h后的上清进行SDS-PAGE发现1条约70 ku的特异条带,经LC-MS/MS鉴定为目的蛋白。...     

猪β干扰素的基因改造及真核表达

本试验选择高表达密码子重新设计合成猪β干扰素成熟肽核苷酸,通过设计特异的引物,在毕赤酵母表达系统中表达PoIFN-β,获得分泌表达的高活性重组PoIFN-β,并采用非洲绿猴肾细胞(Vero)-水泡性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法测定重组猪β干扰素的效价,为指导重组PoIFN-β的临床使用和研究其生物学功能提供基础。     

猪白细胞介素2基因的克隆和酵母表达

以伴刀豆球蛋白A（ConA）诱导的猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出约500 bp的DNA片段,对阳性克隆进行测序与分析。结果：所克隆的基因与GenBank上公布的猪白细胞介素2（PoIL-2）基因的同源性为100%,表明试验成功获得了PoIL-2基因的全序列克隆;以该重组质粒为模板进行PCR,扩增出PoIL-2成熟蛋白的基因片段,连接真核表达载体pPICZαA,成功地构建了重组PoIL-2成熟蛋白基因的真核表达载体pPICZαA-PoIL-2;电转化pPICZαA-PoIL-2于巴斯德毕赤酵母X-33,诱导表达后进行表达产物的SDS-PAGE鉴定,结果表明试验成功地建立了重组PoIL-2的酵母表达系统。     

惠阳胡须鸡IFN-α基因的克隆表达和重组蛋白的抗病毒活性圆二色性分析

IFN-α是一种具有很强抗病毒活性的细胞因子.从惠阳胡须鸡肝脏克隆了IFN-α基因,为新的亚型.将IFN-α成熟肽与毕赤酵母pPICZαA连接,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后确定目的基因无突变并且插入方向正确,将重组质粒转化到GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达,重组IFN-α分子量约为35 kD,表达量达到了0.307 mg/ml,在CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性为3.2×106 U/mg.圆二色实验结果表明IFN-α重组蛋白中含有53.2% α螺旋、3.1% β折叠、10.6%转角和33.1%无规谱卷曲,属于全α型蛋白.结果表明,采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-α,并首次证实鸡IFN-α属于全α型蛋白.     

重组人溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及活性研究

为了构建一种胞内表达人溶菌酶(hLZ)的毕赤酵母工程菌,此研究以人工合成人溶菌酶基因序列,通过酶切位点插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,获得pPICZαA-hLZ。线性化该表达载体,电转化并筛选阳性克隆,甲醇诱导重组蛋白表达后,进行纯化和活性分析。结果表明,通过亲和层析树脂(Ni-IDA)从培养液上清纯化目标蛋白,SDS-PAGE表明目标蛋白为14.7 kDa左右,Western-blot结果表明目标蛋白即为带有6个His标签的重组人溶菌酶,BCA法测定表明纯化后的蛋白浓度为0.121 mg/mL;溶壁微球菌抑菌试验表明该重组人溶菌酶具有部分生物活性。此研究成功地获得了胞内表达且具有部分生物活性的人溶菌酶毕赤酵母工程菌,为重组人溶菌酶作为饲料添加剂开发应用奠定了一定的基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

鸡源志贺菌IpaC基因变构体重组酵母表达载体的构建及初步表达

为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性,实现在酵母表达系统中高效表达,本研究首先采用反向PCR将IpaC基因358~360位和361~363位酵母菌低频密码子突变为偏嗜性密码子,并进一步构建了克隆载体pMD18-T-IpaC*和酵母表达载体pPICZαA-IpaC*,然后将线性化重组质粒pPICZαA-IpaC*电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子进行诱导表达,并用SDS-PAGE检测其表达产物。结果表明SDS-PAGE在大约63 000处检测出目的条带,实现了鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的初步表达。这为进一步研究IpaC生物学功能奠定了基础。     

鸡β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性测定

为研究鸡β干扰素(chicken interferon-β,ChIFNβ)蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗病毒活性,将克隆的ChIFNβ基因亚克隆至酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组质粒pPIC-ChIFNβ。将鉴定正确的质粒pPICChIFNβ线性化,通过电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1.0%甲醇连续诱导4d,表达产物利用SDS-PAGE电泳、细胞病变抑制法等进行分析。ChIFNβ在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子质量约为17ku。表达产物以细胞病变抑制法检测其活性,效价为107.5 U/mL;在鸡胚中能有效抑制禽流感病毒H9N2的增殖。动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白可提供70%的免疫保护。表达的ChIFNβ蛋白具有较好的抗病毒活性,本研究可为ChIFNβ的应用提供重要参考。     

NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。