利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株

PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体，并成功地置换了阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒（aac（3）Ⅳ＋onT）两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌（Eschcrichia．coli）菌株BW25113／pU790／pXW1224，获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4．0kbBglⅡ目的片段插入基因置换载体pHZl35l，再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903，筛选得到表型为Apma^RThio^S的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析，证实该接合子为敞dkdF^-突变株。     

表达禽流感病毒核蛋白重组噬菌体的构建

摘要：利用PCR技术，扩增去除部分序列、长度为1320 bp、编码440个氨基酸的禽流感病毒(AIV)NP基因片段，将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR-NP，以此重组载体转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，重组载体与缺陷噬菌体T4-Z1基因发生同源重组，将NP基因整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-NP。经Western blot检测证实，T4-Z1-NP表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。成功构建了表达禽流感病毒核蛋白的重组噬菌体。     

口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示

本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。     

利用葡萄糖、木糖生产燃料酒精的基因工程菌构建

以运动发酵单胞菌的总DNA为模板，PCR扩增Zymomonas mobilis中的乙醇脱氢酶基因（adhB）和丙酮酸脱羧酶基因（pdc）。首先进行单个基因表达，基因表达产物经SDS—PAGE电泳分析和乙醛指示平板检测，确认有酶活性后，将这2个基因串联构建多顺反子表达质粒pSE—pdc—adhB，转入大肠杆菌DH5a内，得重组工程菌株。工程菌株经IPTG诱导，分别在含10％葡萄糖和10％木糖培养基中于37℃培养72h，有乙醇产生，酒精产率分别为对照菌株21倍和5倍。     

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中能加快啤酒成熟,有重要的应用价值。本研究将枯草芽孢杆菌启动子P43克隆到质粒pUC19-ALDC中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前,得到重组质粒pUC19-P43-ALDC。重组质粒pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN同源重组,筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83-ALDC。用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌1A751,挑选出新霉素抗性且无淀粉酶活性的重组菌株。此菌株用LB培养基在37℃、220r/min摇瓶培养过夜,测得α-乙酰乳酸脱羧酶活力为15.6U/mL,说明整合的α-乙酰乳酸脱羧酶基因能够在重组菌株中稳定传代和表达。本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表达了α-乙酰乳酸脱羧酶,提出了一种有潜力的生产α-乙酰乳酸脱羧酶的新方法。     

甲基营养菌M.sp.MB200中serA基因功能初探

serA基因编码3-磷酸甘油酸脱氢酶（PGDH）,此酶在合成L-丝氨酸的第一步起催化作用。利用质粒pCM80分别与野生型基因serA、缺失了C末端ACT功能域的突变基因serA△77构建了重组体表达菌MB200/pCM80serA和MB200/pCM80serA△77。通过分析发现野生型基因重组表达菌的PGDH酶活受L-丝氨酸浓度影响较大,当反应体系中的L-丝氨酸浓度为40μmol/L时,酶活减少了约1/3;缺失了ACT功能域的基因表达菌的PGDH酶活基本不变,不受L-丝氨酸浓度的影响。进一步在静息细胞反应条件下,对重组菌和野生菌株MB200进行发酵产L-丝氨酸的研究,实验发现MB200/pCM80serA产L-丝氨酸的量为13.6mg/mL,MB200/pCM80serA△77产L-丝氨酸的量为16.8 mg/mL,而野生型菌株M.sp MB200的产量为6.4 mg/mL,重组菌的L-丝氨酸产量都有所提高,且MB200/pCM80serA△77的产量提高更多。结果证实了甲基营养菌MB200中serA基因与产L-丝氨酸具有反馈抑制关系,为进一步解除反馈抑制并发酵产L-丝氨酸奠定了基础。     

tac启动子碱基突变对睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)降解能力的影响

应用PCR技术将发生突变的tac启动子-10区（TATGTT）回复突变为TATATT和TATGAT,构建了两个重组质粒pPM1、pPM2,酶切结果发现pPM1质粒转化大肠杆菌后部分细菌对tac启动子进行切除。将重组质粒分别与pAX1共转化大肠杆菌,提取细菌总蛋白,酶联免疫吸附法测定细菌总蛋白中activator及3α-HSD的表达量,结果表明tac启动子-10保守区为TATATT的质粒比-10保守区为TATGAT的质粒具有更高的转录活性,activator及3α-HSD的表达量高低依次均为pPM1＞pPM2＞pb。根据同源重组原理构建突变菌,并利用HPLC测定了各突变菌对睾凡酮的降解能力,结果表明不同突变菌对睾凡酮的降解能力高低依次为Cp7（C.T.+ pPM1）> Cp4（C.T.+pPM2）> Cb7（C.T.+pb）>C.T.。     

Oenococcus oenj苹果酸-乳酸发酵关键酶基因在酿酒酵母中的转化与表达

利用西北农林科技大学葡萄酒学院筛选出的酒酒球菌(Oenococcusoeni)优良菌系SD-2a的包含苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP)约2.6kb的基因片段,并以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母-大肠杆菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒pYELmleAP,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YS58,筛选获得酵母转化子YS58/pYELmleAP。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了苹果酸-乳酸酶的目的蛋白。对酵母转化子培养上清进行HPLC检测,采用t检验差异显著性分析,结果表明mleA基因在受体菌中进行了功能性表达。获得的酵母转化子在添加L-苹果酸的SD/-Ura培养基中培养4d,培养液中的L-苹果酸含量降低,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量比空载体转化子极显著降低,苹果酸降低19.33%～19.42%。对照未检出乳酸的生成,供试的转化子L-乳酸生成量为1249～1368mg/L,与对照差异显著。     

双价苏云金芽孢杆菌cry基因载体构建及其在大肠杆菌中表达杀虫活性

研究和利用不同苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫蛋白之间的增效作用是构建高效遗传工程虫剂，预防和延缓害虫抗性的重要途径。BtCry1Ab,Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对重要的鳞翅目农业害虫具有主毒力，质粒pHT-BSK含有能在大肠杆菌（Echerichia coli)－枯草芽孢杆菌（B.subtilis)有效表达的生物安全性标记基因卡那霉素抗性基因。将含Btcry1A,cry1Ac和cry2Aa全长基因的Bam HI/PstI,Bam H I/Xho I和Sma I(Bam H I)HindⅢDNA片段与pHT-BSK的应酶切产物连接，获得了单价cry/km^r组合的重组质粒pBlue-1Ab-km^r,pBlue-1Ab和pHT-2Aa;cry1Ab,cry1Ac DNA片段与pHT-2Aa相应酶切产物相连接获得了Bt双价基因／km^r组合重组质粒pBlue-crylAb-km^r-2Aa和pBlue-cry1Ac-km^4-2Aa，重组质粒中所有cry基因与km^r均形成特异的Bam H I片段。限制酶切电泳分析和特异PCR扩增证实了重组质粒的准确连接。含有重组质粒的大肠杆菌显示了对小菜蛾（Plutella xylostella）和玉米暝（Ostrinia furnacalis)的杀虫活性，对小菜蛾双价基因毒力高于单价基因，但对玉米螟它们之间没有明显差异。研究为进一步阐明Bt cry 2Aa与cry1Ab和cry 1Ac之间在不同微生物细胞中的共表达及其表达产物之间的相互作用和构建双价基因杀虫工程菌株创造了条件。     

Oenococcus oeni MLF关键基因在酿酒酵母中的转化与表达

利用西北农林科技大学葡萄酒学院筛选出的酒酒球菌(Oenococcus oeni )优良菌系SD-2a的包含苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP )约2.6 kb的基因片段，并以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以酵母-大肠杆菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleAP，转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58，筛选获得酵母转化子YS58/pYELmleAP。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中，SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了苹果酸-乳酸酶的目的蛋白。对酵母转化子培养上清进行HPLC检测，采用t检验差异显著性分析，结果表明mleA基因在受体菌中进行了功能性表达。获得的酵母转化子在添加L-苹果酸的SD/-Ura培养基中培养4 d，培养液中的L-苹果酸含量降低，培养液上清中L-苹果酸的剩余含量比空载体转化子极显著降低，苹果酸降低19.33%～19.42%。对照未检出乳酸的生成，供试的转化子L-乳酸生成量为1249～1368 mg/L，与对照差异显著。