烟芽夜蛾囊泡病毒3h株对草地贪夜蛾幼虫的感染特性及对其生长发育的影响

为寻找有效防控外来入侵物种草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的技术,以烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h)为研究对象,通过测定不同龄期草地贪夜蛾幼虫口服或针刺感染HvAV-3h后的死亡率、存活时间、取食量及体重,分析该毒株对草地贪夜蛾幼虫的感染特性及对其生长发育的影响。结果显示,草地贪夜蛾1、2龄幼虫口服HvAV-3h后的校正死亡率分别为9.22%和0,3～6龄幼虫针刺感染HvAV-3h后的校正死亡率则高达100.00%,感染HvAV-3h的幼虫均在幼虫期或蛹期死亡。3～5龄幼虫针刺感染HvAV-3h后的存活时间明显长于健康幼虫;3～6龄幼虫针刺感染HvAV-3h后其体重和取食量均受到不同程度的抑制作用,体重抑制率分别为67.79%、41.68%、16.31%和10.30%,总取食量抑制率分别为57.80%、33.90%、17.42%和41.82%;其中3龄幼虫针刺感染HvAV-3h后的体重和取食量被显著抑制,且蜕皮困难,最终在幼虫期死亡;部分4～6龄感染HvAV-3h幼虫能够完成化蛹,但是均无法羽化。表明HvAV-3h感染能够有效控制草地贪夜蛾幼虫,有望开发为草地贪夜蛾的生防制剂。     

棉花转甲基酶基因GhBSMT1的克隆、原核表达及表达谱分析

采用RT-PCR结合RACE技术从陆地棉中棉所12中克隆得到全长为1280 bp的苯甲酸/水杨酸羧基甲基转移酶基因序列,命名为GhBSMT1。预测该转移酶分子量40.8 kD,等电点6.12,为不稳定的亲水蛋白。通过原核表达获得大小约41 k D的可溶性重组目标蛋白。利用实时荧光定量PCR技术检测了棉花中GhBSMT1在植物激素处理和棉铃虫取食后表达转录情况,发现GhBSMT1在棉花的根、茎和叶中均有表达。水杨酸甲酯(Me SA)处理能够引起GhBSMT1下调表达,而茉莉酸甲酯(Me JA)处理对靶标基因影响不显著。另外,棉铃虫取食棉株6 h或48 h后,GhBSMT1表达量显著降低。结果表明,GhBSMT1在棉花各组织均有分布并受外源Me SA调控,该基因的表达还被棉铃虫取食抑制。     

棉铃虫脂肪酸结合蛋白的克隆与表达

为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。     

葡萄卷叶伴随病毒-3外壳蛋白的原核表达及其特异性抗血清的制备

利用RT-PCR技术扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)中国分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)基因。序列分析结果表明,cp基因的长度为942bp,与已报道的其它GLRaV-3分离物的cp核苷酸相似性为91%～99%,编码的氨基酸相似性为95%～100%。将此基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,cp在大肠杆菌中可表达出分子量约为35kDa的蛋白。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)及斑点免疫结合测定(DBIA)结果显示,制备的特异抗血清可用于检测田间感病葡萄样品中的GLRaV-3。     

甘薯褪绿矮化病毒RNase3蛋白的原核表达及抗血清制备

以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,RNase3在大肠杆菌中能高效表达,融合蛋白分子量约为26.5kD。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPCSV-RNase3的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。     

水稻齿叶矮缩病毒非结构蛋白Pns7在水稻原生质体内的表达动态

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)。该病毒编码的非结构蛋白Pns7在昆虫细胞中可形成伸出细胞膜的纤维丝状结构。本研究利用水稻原生质体培养体系,对Pns7蛋白在水稻原生质体内的复制与表达情况进行了分析。本研究首先构建了Pns7蛋白的原核表达载体,通过IPTG诱导获得大量Pns7蛋白,免疫兔子获得抗血清。Western blot证明抗血清具有特异性,间接ELISA测得其效价为1∶2 500。利用实时荧光定量PCR技术,对病毒侵染水稻原生质体后的Pns7 RNA含量进行检测,结果表明:Pns7 RNA在8 h时开始积累,24h左右达到最大值,32 h后表达量维持在一个平台期;同时,以制备的抗血清为探针,通过Western blot检测到Pns7蛋白在病毒侵染原生质体后16 h开始表达,32 h左右达到最大值,60 h后开始下降,但仍保持在较高水平。     

棉铃虫幼虫取食转HaHR3基因烟草后中肠组织的病理变化

<正>通过植物介导的RNAi能够沉默棉铃虫蜕皮调节转录因子Ha HR3基因。棉铃虫取食含有dsRNAs的转基因烟草后,其Ha HR3基因的转录水平及蛋白表达水平均被有效抑制,导致棉铃虫幼虫生长发育畸形或死亡(尹富仕等,2010;Xiong et al.,2013)。本研究利用透射电镜观察棉铃虫取食转Ha HR3基     

白背飞虱VAMP7和Vti1a蛋白的原核表达、抗体制备及应用

白背飞虱Sogatella furcifera的囊泡相关膜蛋白7(VAMP7)和囊泡转运蛋白(Vti1a)隶属于SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)家族,该家族蛋白主要参与生物体中关键的膜转运过程。前期研究发现这两种蛋白分别与南方水稻黑条矮缩病毒Southern rice black-streaked dwarf virus(SRBSDV)的主要外层衣壳蛋白P10存在显著互作,推测可能协助病毒粒体在介体白背飞虱内的转运和扩散。为了进一步利用血清学技术研究VAMP7和Vti1a在传毒过程中的功能,本研究克隆了白背飞虱编码这两种蛋白的基因,成功构建了VAMP7和Vti1a基因的原核表达载体,并将载体分别转入大肠杆菌中进行诱导表达,得到了相应的原核表达蛋白。在蛋白纯化后,将纯化蛋白注射于新西兰大白兔体内进行免疫,分别制备得到VAMP7和Vti1a的抗体。两种抗体经Western blot检测发现,均可分别与白背飞虱体内的VAMP7和Vti1a特异性结合。利用制备的抗体对白背飞虱的肠道进行免疫标记,激光共聚焦显微镜观察发现所制备抗体能够在白背飞虱中肠上皮细胞的胞质中特异性标记到VAMP7和Vti1a,表明制备的抗体能够成功用于这两种蛋白的体内外检测,为阐明这两种蛋白参与传播SRBSDV的机制研究奠定了基础。     

玉米黄花叶病毒运动蛋白的原核表达纯化与抗血清制备

为实现对玉米黄花叶病毒（maize yellow mosaic virus,MaYMV）的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白（movement protein,MP）的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性...     

灰飞虱VAP-B蛋白的抗体制备及体内外应用

灰飞虱Laodelphax striatellus的囊泡相关膜蛋白相关蛋白B(VAP-B)是内质网膜蛋白家族的蛋白,其主要参与调节囊泡运输、脂类的转运代谢以及未折叠蛋白应答等。本研究克隆了灰飞虱VAP-B基因,构建了pCold-SUMO-VAP-B原核表达载体,再将其转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3),经过IPTG低温诱导表达得到了含有HIS和SUMO标签的VAP-B可溶性蛋白,经过Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化后的蛋白再利用rTEV酶去除SUMO标签,得到无标签的VAP-B蛋白。通过免疫新西兰雄兔制备了VAP-B的多克隆抗体。Western blot检测结果表明该抗体可以特异性检测到灰飞虱的VAP-B蛋白;同时利用该抗体进行免疫荧光标记,发现其能特异性定位灰飞虱唾液腺内的VAP-B蛋白。研究结果表明制备的VAP-B抗体能够成功用于该蛋白的体内外检测,为阐明VAP-B在灰飞虱体内的关键作用奠定了基础。     

Bt抗性和敏感棉铃虫钙黏蛋白及氨肽酶N1表达量的比较

棉铃虫体内的钙黏蛋白（CAD）和氨肽酶N1（APN1）是Bt的主要作用靶标,两种受体蛋白的变化也是棉铃虫对Bt产生抗性的主要原因。本文利用实时荧光定量PCR技术比较了Bt抗性和敏感棉铃虫CAD和APN1的表达量变化,分析受体蛋白表达量变化与抗性的关系。结果表明,与敏感品系相比,抗性品系棉铃虫CAD和APN1的表达量明显降低,1、2龄幼虫的差异达到极显著。在敏感品系中,CAD和APN1的表达量随龄期的增加呈现“V”字形变化,1、2龄幼虫的表达量最高,3、4龄时显著降低,到5龄时表达量又有所增加。抗性品系中CAD和APN1的表达量提前降低,与表达量最高的1龄幼虫相比,2、3龄时表达量显著降低,到4、5龄时又略有回升。说明棉铃虫中肠钙黏蛋白、APN1表达量的下降与抗性相关,且不同龄期棉铃虫幼虫表达量不同。     

棉铃虫 JNKs 基因的克隆及表达分析

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是MAPK家族(mitogen-activated protein kinases, 丝裂原活化蛋白激酶)的重要成员, 具有参与昆虫抗逆反应等多种功能。为明确JNK在棉铃虫 Helicoverpa armigera 中的表达特性及其对Bt杀虫蛋白的应激与免疫反应, 本研究通过PCR克隆得到2个棉铃虫 JNK 基因 HaJNK1 和 HaJNK2; 生物信息学分析结果显示: HaJNK1和 HaJNK2基因开放阅读框分别为1 191、1 143 bp, 分别编码397、381个氨基酸。系统进化树分析结果表明棉铃虫 HaJNK1 与黏虫 Mythimna separata 聚为一支, 亲缘关系较近, HaJNK2与 家蚕 Bombyx mori 聚为一支, 同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术分析 HaJNK1 与 HaJNK2 在棉铃虫不同发育时期、不同组织中的表达量, 发现 HaJNK1 与 HaJNK2 在卵中表达量最高, 其次是雌成虫; HaJNK1 在性腺中表达量最高, 其次是唾液腺; HaJNK2 在头部表达量最高, 其次是性腺。取食Cry1Ac的4龄棉铃虫幼虫的中肠组织中, HaJNK1 与 HaJNK2 的表达量均显著升高。推测 HaJNKs 基因可能参与棉铃虫抵御Bt杀虫蛋白伤害的应激和抗逆反应。     

感染微孢子虫的棉铃虫幼虫对化学杀虫剂的敏感性

为明确棉铃虫微孢子虫Nosema sp.与杀虫剂混用的效果及其机理,采用感染饲喂和微量点滴法,研究了感染微孢子虫的棉铃虫幼虫对辛硫磷、溴氰菊酯的敏感性变化.健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷LC50之比为4.855,对溴氰菊酯LC50之比为7.953.随着微孢子虫感染时间和感染剂量的增加,棉铃虫对杀虫剂的敏感性进一步增强;感染微孢子虫5天,健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷的LC50之比为3.278,与感染3天处理相比差异显著;当剂量为107个孢子/mL时,健康幼虫与感病幼虫对辛硫磷的LC50之比为4.090.经微孢子虫处理后,棉铃虫幼虫体内的羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的比活力均增高.     

羧肽酶在Bt抗性棉铃虫中肠的表达分析

本研究利用实时定量PCR技术检测了对Bt(Bacillus thuringiensis)Cry1Ac敏感和抗性品系棉铃虫Helicov-erpa armigera中肠羧肽酶(carboxypeptidase)的mRNA表达,发现在抗性品系中羧肽酶表达量明显下降(约2.6倍);中肠汁液中羧肽酶酶活测定结果表明,抗性品系羧肽酶酶活性同样显著下降约2.2倍。羧肽酶作为重要的消化性外切酶(exopeptidase),能够消化摄取食物中的大量可吸收的蛋白质,抗性品系羧肽酶表达量显著下降表明该种群消化食物的能力降低,这可能会导致与抗性适合度相关的多种生理指标的下降。另外,体外成功表达棉铃虫羧肽酶,为从蛋白和抗体水品进一步研究羧肽酶在棉铃虫抗性适合度中的作用奠定基础。     

利用蝎毒基因改良杆状病毒杀虫剂

杆状病毒(Baculovirus)是昆虫及某些甲壳类动物的专性病原体,昆虫杆状病毒杀虫剂是公认的一类无公害的生物农药,联合国世界卫生组织(WHO)和粮农组织(FAO)早已推荐用于农作物害虫生物防治。但是,杆状病毒都有一个共同的缺点,就是杀死害虫时间太长(一般室内需要5—7天,田间需要时间更长)。由于这一缺点,使杆状病毒杀虫剂的商品生产和推广应用受到很大限制,甚至停滞不前。 本研究通过人工合成一种对昆虫专性的蝎子Androctonus anstralis神经毒素AaIT的编     

嗜线虫致病杆菌对棉铃虫的生物活性研究

嗜线虫致病杆菌HB310(Xenorhabdus nematophila HB310)菌液中主要的杀虫活性物质是一种高分子量的复合蛋白—毒素Ⅱ。以该菌液和毒素Ⅱ分别饲喂棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫,检测其对棉铃虫生长发育的影响,同时通过生化分析研究了该毒素对幼虫中肠内几种蛋白酶活力的影响。结果表明:菌液和毒素Ⅱ对棉铃虫幼虫的取食量和生长发育均有显著的影响,取食拌有菌液和毒素Ⅱ的人工饲料的棉铃虫食量明显减少,发育速度延缓,发育历期比对照明显推迟;尽管一直取食混合原菌液(6.5×108 cells/mL)人工饲料的棉铃虫2龄幼虫前期死亡率很低,但是其生长发育几乎完全被抑制,该处理组所有幼虫均不能化蛹;原菌液对4龄幼虫的食量、发育历期、蛹重及化蛹率均有显著影响。菌液对棉铃虫幼虫的影响与菌液的浓度和幼虫的龄期成反比,稀释50倍的菌液对2龄和4龄幼虫的生长发育仍有一定影响;毒素Ⅱ(51.9 μg/mL)对4龄棉铃虫的生长发育也有明显的抑制作用。短时间(2 d)饲喂原菌液后更换正常饲料,仅延缓了棉铃虫幼虫的发育历期,而对其化蛹率、蛹重及羽化率均无明显影响。饲喂毒素Ⅱ的棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶的活性受到明显的抑制。     

雷公藤总生物碱对几种昆虫的生物活性

为进一步确定雷公藤总生物碱的杀虫作用谱和作用方式,评价其应用前景,采用室内生测法研究了对小菜蛾、菜青虫、棉铃虫、黏虫、玉米象、桃蚜、山楂叶螨、家蝇的生物活性。结果表明,雷公藤总生物碱对小菜蛾3龄幼虫、黏虫3龄幼虫、菜青虫5龄幼虫、桃蚜无翅成蚜、山楂叶螨雌成螨和棉铃虫3龄幼虫48 h的毒杀活性LC50分别为228.28、306.39、307.61、0、435.90、622.17、653.00 mg/L,72 h后LC50分别为136.67、216.12、238.18、309.67、485.36、463.00 mg/L;对家蝇成虫也有较好的毒杀作用;对棉铃虫幼虫生长有明显抑制作用;对玉米象有较强的种群抑制作用。     

昆虫病毒重组增效蛋白的广谱增效活性

室内生物测定表明 ,大肠杆菌表达的粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白P96可显著或极显著提高棉铃虫核型多角体病毒、苏云金杆菌和阿维菌素对棉铃虫幼虫的致死率 ,分别提高1 6 9.78%、73.90 %和 36 .0 4 % ;对苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒感染甜菜夜蛾幼虫也有明显增效作用。Na2 CO3 溶解的P96对棉铃虫初孵幼虫有一定致死作用。