杧果炭疽病菌谷氨酸转运蛋白基因Cgglt1功能分析

【目的】探明谷氨酸转运蛋白基因Cgglt1与杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)致病力的关系,以便为该病害发生机制的研究提供理论依据。【方法】利用In-Fusion~?HD Cloning Kit技术构建Cgglt1敲除载体,转化杧果炭疽病菌原生质体,对获得的敲除突变体进行表型分析。【结果】获得敲除载体p Cgglt1GH1和敲除突变体△Cgglt1,表型测定显示,与野生型相比,突变体△Cgglt1菌落颜色变浅、生长速率略下降、产孢量显著下降、孢子萌发加快但不能形成附着胞,对pH的适应性有所改变,对杧果叶片的致病力显著下降。【结论】Cgglt1基因调控C.gloeosporioide菌落生长、产孢量、孢子萌发率、附着胞的形成、对pH的敏感性及对杧果叶片的致病力。     

广西杧果炭疽病菌种类的构成与分布

【目的】利用多基因手段结合形态学特征重新确定广西杧果炭疽病菌的分类地位,并统计分析各种类病菌的分布,了解广西杧果炭疽病菌的种类和优势群体,为进一步研究我国杧果炭疽菌及其病害的诊断、防控提供有力依据。【方法】从广西百色市、南宁市、钦州市等杧果产地采集杧果不同部位的炭疽病害样本,采用组织分离法进行分离,对所得分离物进行致病性测定,证明为杧果炭疽病菌。对病菌的ITS和ACT、GPDH、TUB2、CAL多基因位点进行扩增和测序,各基因序列按ITS、GPDH、ACT、TUB2、CAL的顺序相连接形成复合序列,采用MEGA 6.06软件以邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树,结合病菌的形态特征鉴定其分类地位,并统计各种类病菌的总分离率及其在不同地区、植株不同部位的分离率。【结果】获得50株杧果炭疽病菌菌株,分别属于3个种:Colletotrichum asianum、C.fructicola、C.siamense,其中36株为C.asianum、12株为C.fructicola、2株为C.siamense。C.asianum、C.fructicola、C.siamense的总分离率分别为72%、24%、4%;C.asianum在所有检测地区、植株部位均能分离到,且分离率均最高,超过57.1%;C.fructicola能从所有检测地区、枝条以外的植株部位分离到,其中花梗上的分离率最高,为42.9%;C.siamense仅从百色市的果实上分离到,分离率为13.3%。【结论】广西杧果炭疽病菌主要有C.asianum、C.fructicola和C.siamense 3个种,均属于C.gloeosporioides复合种,其中C.asianum为优势种,C.fructicola是我国杧果炭疽病菌的新记录种;病菌的种类与地理来源、侵染部位无明显相关性。     

杧果查尔酮合成酶基因(CHS1)的克隆与表达分析

【目的】克隆鉴定杧果CHS基因,分析其功能,明确杧果不同组织器官中CHS基因表达情况。【方法】以海南种植的6个杧果种的叶片总DNA和c DNA为模板,进行同源性PCR扩增,然后克隆到p MD18-T载体上,进行测序;通过生物学软件预测分析CHS基因编码的蛋白质;运用半定量PCR分析CHS基因表达情况。【结果】测序得到6个杧果种CHS基因c DNA全长为1 173 bp,CHS基因含有2个外显子和1个内含子。基于c DNA序列的NJ系统发育树显示,其与普通杧果(Mangifera indica)CHS1基因同源性最高。CHS1基因半定量表达显示杧果不同器官均表达CHS1基因,但在叶片和花中的表达量较高。【结论】克隆了杧果查尔酮合成酶1(CHS1)基因,半定量分析了杧果不同器官中CHS1基因的表达差异,为下一步研究提高CHS1基因的表达量奠定了基础。     

抑菌物质肉桂醛防治杧果炭疽病机制研究

采用生长速率法测定了植物源抑菌物质肉桂醛对杧果炭疽病菌的毒力作用,同时从杧果内防御酶变化角度探讨其防病机制。结果表明,肉桂醛防治杧果炭疽病的最佳使用质量浓度为30 mg.L-1,13 d的防治效果为56.67%,肉桂醛对杧果炭疽病菌菌丝生长和分生孢子萌发的EC50分别为38.51和22.34 mg.L-1,当肉桂醛质量...     

杧果细菌性角斑病病原菌XC01菌株的全基因组测序及序列分析

【目的】由柑橘黄单胞菌杧果致病变种引起的杧果细菌性角斑病是杧果生产上的重要病害,解析杧果细菌性角斑病病原菌(柑橘黄单胞菌杧果致病变种)XC01菌株的基因组序列信息,为深入研究病菌的致病机制提供序列背景信息。【方法】利用PacBio RS II测序平台对柑橘黄单胞菌杧果致病变种XC01菌株进行全基因组测序,并对测序数据进行序列拼接、基因预测与功能注释、COG/GO聚类分析等。【结果】柑橘黄单胞菌杧果致病变种XC01菌株整个基因组大小为3 865 165 bp,GC含量为68.9%,编码3 442个蛋白基因,共有3 297个基因具有明显的生物学功能,其中150个基因参与碳水化合物代谢,582个基因参与到寄主与病原互作机制中。序列提交至GenBank数据库,登录号为CP016836。【结论】本研究首次报道了杧果细菌性角斑病病原菌的全基因组序列,分析了基因组的基本特征,初步解释了该菌株致病的关键基因,为深入开展该病菌侵染植物的作用机制提供重要的理论基础。     

杧果MiCO基因的克隆与表达模式分析

【目的】克隆杧果(Mangifera indica L.)MiCO基因并探讨其表达模式,为深入研究该基因的功能奠定基础。【方法】根据从杧果转录组测序数据中获得一个MiCO基因全长序列信息,设计基因全长引物,克隆具有不同开花习性的‘四季杧’和‘紫花杧’2个品种的MiCO基因全长序列,对其序列进行生物信息学分析,并利用荧光定量PCR技术对MiCO基因在杧果不同组织以及年周期的表达情况进行分析。【结果】序列分析显示,2个杧果品种的MiCO基因c DNA全长均为1 150 bp,都包含1个966 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸,等电点为5.8,‘四季杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.30 ku,‘紫花杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.22 ku;MiCO基因编码的蛋白具有典型的CO同源蛋白结构,包括B-box1、B-box2和CCT结构域;系统进化树表明,杧果MiCO蛋白属于第一类CO蛋白,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)At COL4相似性最高而聚类到一起。基因表达分析表明,MiCO基因在杧果不同组织中均表达,但不同组织的表达水平存在差异。年周期表达分析表明,MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,而且在来年的5—6月还存在一个小的表达高峰期,但2个品种不同组织中MiCO基因表达存在差异。【结论】克隆获得杧果MiCO基因全长序列,发现2个具有不同开花习性的杧果品种的MiCO基因核苷酸和氨基酸序列高度同源,只存在少许差异。MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,说明MiCO基因与杧果成花关系密切。     

杧果红点病病原菌的鉴定

在海南杧果果实上发现了一种由炭疽病菌引起的杧果红点病,通过菌种分离与纯化、致病性测定、形态学观察和rDNA-ITS序列分析,对引起杧果红点病的病原菌进行了鉴定。病原菌回接后,杧果果皮上出现凸起的褐色或黑色坏死斑点,周围有红色或暗红色晕圈,这与田间自然发病果实症状一致;在PDA培养基上培养后,杧果红点病原菌菌落呈圆形,灰色,气生菌丝绒毛状,后期产生桔红色孢子堆;病原菌的rDNA-ITS基因序列与已有的杧果炭疽菌rDNA-ITS核苷酸序列同源性高达100%。结果表明,杧果红点病病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.。     

杧果MGAPDH同源基因的克隆及其表达分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是糖代谢和能量代谢过程中的关键酶。根据GAPDH基因保守序列设计PCR引物,利用RT-PCR和改良RACE技术,首次从杧果中分离克隆出MGAPDH同源基因的cDNA全长序列。该序列全长为1 356 bp,开放阅读框为1 203 bp,编码401个氨基酸。利用分子生物学软件对MGAPD...     

香蕉穿孔线虫β-1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆与特征分析

 植物寄生线虫的分泌物在线虫的侵染过程中具有重要的作用,其中纤维素水解酶是研究的较多的主要分泌物之一。采用RT-PCR和RACE方法,从香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）中获得编码β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA序列,命名为RS-eng-1 （GenBank登录号为EU414839）。该cDNA序列全长为1 630 bp,包含一个1 404 bp的开放阅读框（ORF）,编码含467个氨基酸的蛋白,理论分子量与等电点分别为48.22 kD和6.04。序列分析表明该酶含有糖基水解酶家族5（GHF5）的保守结构域,N端具有22个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域（CBDⅡ）。原位杂交结果显示此基因在相似穿孔线虫的食道腺部位表达,并且Southern结果显示其为多拷贝基因。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含6个内含子,切割点符合5'-GT...AG-3'的规律。进化分析显示该酶与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora 分泌的纤维素酶属于同一支,推测其来源于细菌的水平基因转移。     

杧果炭疽病病原菌侵染特性研究

采用细胞组织学和扫描电镜观察杧果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides在杧果叶片、果实上的侵染过程,并研究了温度、湿度、刺伤对其发病情况的影响。结果表明,杧果炭疽菌在条件适宜情况下,可在3h内萌发并侵入寄主组织;伤口可促进杧果炭疽菌分生孢子的萌发,但不利于附着胞的形成。20~28℃之间,温度越高发病越重;湿度69.2%~85.4%之间,湿度越高发病越重,且伤口可加重杧果炭疽病发生。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

杧果低分子量热激蛋白基因MiHSP17.6的克隆及表达分析

采用RT-PCR与RACE相结合的方法获得了杧果低分子量热激蛋白基因的cDNA全长序列,命名为MiHSP17.6,GenBank登录号为KJ459857。序列分析显示,该基因序列全长为680 bp,其中开放阅读框为462 bp,编码154个氨基酸,5′非编码区和3′非编码区长度分别为80 bp和135 bp。杧果MiHSP17.6与其他物种的低分子量热激蛋白同源性介于74% ~ 82%。实时荧光定量分析表明,MiHSP17.6在‘四季杧’不同组织器官中均表达,在果实发育的中期表达水平持续上升。高温（44 ℃）、低温（4 ℃）、盐（NaCl）、聚乙二醇（PEG）、脱落酸（ABA）、双氧水（H2O2）和水杨酸（SA）处理均诱导该基因表达,因此推测MiHSP17.6的功能可能与杧果果实发育和抵御逆境胁迫相关。     

桦褐孔菌纤维素酶基因的克隆与原核表达

成功获得了桦褐孔菌(Inonotus obliquus)JL 01菌株的内切葡聚糖酶(IO-EG)和β-葡萄糖苷酶(IO-BGL)的cDNA全长序列.eg2基因cDNA序列全长(ORF)为1149 bp,编码382个氨基酸,bgl2基因cDNA序列全长(ORF)为2583 bp,编码860个氨基酸;成功构建了30a-eg2和30a-bgl2大肠杆菌表达菌株,诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析表明两个菌株均表达蛋白,且蛋白以包涵体形式存在,为桦褐孔菌高效外源基因表达系统的建立提供了基础.     

不同杧果品种果实对炭疽病的抗病性

杧果炭疽病是杧果生产上最普遍流行、为害最严重的病害之一[1].其病原菌为胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz..由于广西杧果生长发育和成熟采收季节高温多雨,所以杧果采后病害发生十分严重,常造成重大经济损失,成为制约广西杧果产业发展的首要问题.目前,杧果炭疽病防治以化学防治为主,成本高、效果差,并且存在果实农药残留和环境污染等安全问题[2].因此,选择种植抗病力强的品种被认为是控制杧果炭疽病等病害最安全有效的方法.近年来,广西杧果种植业稳步发展,引进了大量新品种和种质,主栽品种格局也在发生变化.生产中已发现,不同杧果品种抗病能力存在着显著差异[3].     

杧果MiLCYB2基因启动子的克隆与序列分析

【目的】了解杧果Mi LCYB2基因的表达调控规律。【方法】应用染色体步移方法克隆了991 bp的Mi LCYB2基因启动子序列。【结果】用在线软件Plant CARE分析表明,该序列除含有启动子基本元件,如TATA-BOX、CAAT-BOX外,还含有ABA、GA、Auxin、SA、Me JA多种植物激素响应元件,以及参与生理周期调控、MYBHv1结合位点和光响应元件等一些其他的调控序列,推测Mi LCYB2基因的表达受多种植物激素、光照、生理周期、MYBHv1转录因子等的调控。【结论】杧果Mi LCYB2基因启动子的分离与序列分析为进一步探究杧果类胡萝卜素基因的调控机制提供了新的理论基础。     

杧果MADS-box基因保守区片段的克隆与序列分析

为从杧果中克隆新的MADS-box基因,利用MADS-box转录因子的保守特征设计简并引物,应用RT-PCR从杧果花序中成功分离出14条MADS-box基因cDNA片段。片段长度在138~147bp之间,推导的氨基酸序列与已知的杧果MADS-box基因的同源性为65.2%~82.6%。用推导的氨基酸序列与已知的杧果和拟南芥MADS-box基因进行系统发育分析,可将这些片段归入MADS-box的不同亚家族中。表明杧果花序中存在多种MADS-box转录因子,参与杧果花器官的发育及开花时间的调节。     

杧果细菌性角斑病菌phd基因克隆与序列分析

由柑桔黄单胞菌杧果致病变种Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae引起的杧果细菌性角斑病是杧果上一种重要的细菌性病害,严重危害杧果产业发展。本试验获得了柑桔黄单胞菌杧果致病变种菌株Xcm003 phd基因的全序列。序列分析显示,phd基因编码85个氨基酸,其理论分子量9.68 kD,理论等电点为9.39,是一种亲水性蛋白,无信号肽,有6个磷酸化位点以及1个结构域。系统进化树结果显示,该基因的氨基酸序列与X.citri pv.mangiferaeindicae LMG941的Phd蛋白聚为一类。     

基于mtDNA-COI序列的杧果象甲遗传多样性分析

对13头杧果食叶性象甲和5头杧果果核象甲Sternochetus mangiferae(Fabricius)mtDNA-COI基因进行序列特征分析。结果表明,杧果象甲mtDNA-COI基因序列长度611~658 bp,平均碱基组成为A 29.78%、T 35. 60%、G 15.93%、C 18.70%,碱基A+T含量显著高于G+C含量,表现出明显的A+T偏好性特点。NJ系统发育树将18份杧果象甲分为2大类群,象甲1-4、1-6与其他象甲亲缘关系较远,组成类群I;其余16份象甲组成类群II。其中象甲1-2与5份杧果果核象甲的遗传分歧最小,结合形态特征鉴定其为杧果切叶象甲Deporaus marginatus Pascoe,它们共同组成亚类群IIa;其余10头象甲聚为亚类群IIb,18份杧果象甲之间存在不同程度的遗传分歧。研究证实了mtDNA-COI基因多态性在一定程度上能够反映出杧果象甲之间的相似性与差异性,适用于杧果象甲物种鉴定和系统发育分析,可为进一步开展杧果象甲的分子生物学研究奠定基础。     

杧果叶绿素a/b结合蛋白基因cDNA全长克隆及其序列分析

采用RT-PCR方法克隆得了杧果叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)cDNA全长序列,命名为Mcab(GenBankaccession No.FJ907952)。Mcab基因全长为915bp,编码264个氨基酸,推测蛋白质分子质量为28.19ku,等电点为5.35。同源性分析表明,Mcab基因在不同植物中的一致性为72%～85%。实验分析表明,杧果Mcab基因编码的蛋白中第63～232位有一个捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,并且在木本植物中非常保守。亚细胞定位分析显示Mcab蛋白被定位于叶绿体,它所编码的蛋白质在绿色植物光合系统中起着重要作用。蛋白二级结构预测显示,Mcab蛋白有8个α-螺旋,5个β折叠区,21个β-转角。研究将有助于进一步了解杧果光合作用的分子机制。     

杧果炭疽病病原菌鉴定及生物学特性研究

对杧果炭疽病菌进行分离鉴定及生物学特性研究。结果表明,杧果炭疽病病原菌鉴定为胶孢炭疽Colletotrichum gloeosporioides Penz.。菌丝生长和分生孢子萌发适宜温度分别为25~32℃和20~32℃;适宜pH值分别为6~9和5~8。供试7种碳源中,蔗糖和葡萄糖最有利于菌丝生长,蔗糖和麦芽糖最有利于分生孢子萌发;供试7种氮源中,蛋白胨有利于菌丝生长和分生孢子萌发。光暗交替有利于菌丝生长和孢子萌发,分生孢子致死温度和时间为55℃处理15分钟。