PCR检测鸭疫里默氏菌的研究

对本研究室分离、鉴定并保存的42株鸭疫里默氏菌(包括8个血清型)、9株鸭源大肠杆菌和4株鸭源禽多杀性巴氏杆菌进行PCR扩增,结果所有的鸭疫里默氏菌均能扩增出809bp的特异性DNA片段,而鸭源大肠杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌均为阴性。试验证明以细菌DNA和全菌体分别作模板,对PCR的扩增结果无影响。经过优化的该PCR方法能检测出的最低DNA量为1pg。     

1 型鸭疫里默氏杆菌铁依赖抑制子RaDtxR 全长 基因的扩增及生物信息学分析

为了扩增1型鸭疫里默氏杆菌铁依赖抑制子基因（RaDtxR）全长序列,对SiteFing-PCR技术做了改良。改良后的SiteFinding-PCR 技术更加简单、方便且省时。SiteFinding-PCR结果显示,获得的目的片段大小为937 bp,向前延伸了710 bp。RaDtxR 全长基因序列为654个核苷酸,编码217个氨基酸。生物信息学表明,RaDtxR包含完整的铁离子依赖抑制子超家族保守结构域,在进化分类上更接近于白喉棒状杆菌毒素抑制子DtxR。同源建模表明,RaDtxR氨基酸序列含有典型的FUR/DtxR抑制子的HTH 结构。     

鸭疫里默氏菌病传染类型的研究

为了探明鸭疫里默氏菌病的传染类型，对两组不同日龄的鸭人工感染鸭疫里默氏菌，于接种感染后不同时间测定其血液中细菌含量，白细胞分类计娄的动态变化，并观察其临床症状和病理变化，结果表明：两组鸭在接种感染后一个较长的时间内其外周血液中细菌含量持续大幅度上升，并且在整个试验过程中都能在血液中查到鸭疫里默氏菌，结合临床症状和病理变化，得出鸭疫里默氏菌病是一种急性或亚急生的败血型传染病，在感染12－24h后出现菌血症，后瞬即发展为败血症经过。     

鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因生物信息学分析及其原核表达

[目的]了解鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因分子生物学特性,确定其编码蛋白抗原性,为鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗研发提供新的靶标抗原选择.[方法]采用PCR克隆鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因,以DNASTAR和NCBI数据库分别进行基因生物信息学分析;利用pCold-TF原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并分别以SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达形式及其抗原特异性.[结果]从鸭疫里默氏杆菌基因组扩增获得的AS87-01740基因编码框全长618 bp,编码205个氨基酸,理论分子量约21.87 kD,理论等电点(pI)8.2,正电荷氨基酸总数17个,负电荷氨基酸总数16个.AS87-01740蛋白序列在同种属分离株中,与2型血清型分离株(11845、YM、GD和CH-2)有很高的相似性(>99%),与1型血清型分离株(CH-1和CH-3)的相似性为92%;在不同种属中,与金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、动物溃疡伯格菌(Bergeyella zoohelcum)和脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabeth-kingia meningosepticum)的相似性分别为61%、60%和57%.经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得的融合蛋白分子量约77 kD,以可溶性表达形式为主.Western blotting检测结果表明,融合蛋白能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生特异性免疫反应.[结论]AS87-01740基因编码蛋白在不同鸭疫里默氏杆菌分离株中具有很高的保守性,且能与其阳性血清发生特异性免疫反应,是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原.     

鸭疫里默氏杆菌Tet(X)基因原核表达及其功能鉴定

[目的]确定鸭疫里默氏杆菌Tet(X)基因是否与四环素类耐药相关,寻找出抗鸭疫里默氏杆菌药物研发新靶点.[方法]克隆鸭疫里默氏杆菌Tet(X)基因,以大肠杆菌原核表达体系进行诱导表达,利用生物信息学软件分析原核表达蛋白的功能和特性,并采用实时荧光定量PCR检测四环素和多西环素对鸭疫里默氏杆菌Tet(X)基因的调控作用.[结果]从鸭疫里默氏杆菌基因组扩增获得的Tet(X)基因编码框全长1167 bp,编码388个氨基酸,其编码蛋白分子量约42.53 kD,理论等电点(pI)为10.073,与AS87_09615(Yb2)、RIA_0369(YA-GD)、RAYM_08235(RA-YM)、G148_1777(RA-CH-2)、RIA_0365(YA-GD)、G148-1767(RA-CH-2)、B739_0035(RA-CH-1)和B739_0030(RA-CH-1)等8个来源于不同种鸭疫里默氏杆菌的蛋白具有较高同源性(96%~100%).利用原核表达体系诱导表达获得的Tet(X)融合蛋白分子量约45.40 kD,且主要以包涵体的形式表达.Tet(X)融合蛋白能有效提高宿主菌株对典型四环素类药物(四环素和多西环素)的最小抑菌浓度(MIC);实时荧光定量PCR检测结果显示,四环素和多西环素对鸭疫里默氏杆菌Tet(X)基因表达量的调控呈非线性.四环素浓度为0~4 mg/L时,Tet(X)基因相对表达量随药物浓度的增加而逐渐增加;浓度为4~12 mg/L时,Tet(X)基因相对表达量随药物浓度的增加而逐渐降低.多西环素药物浓度为0~3 mg/L时,Tet(X)基因相对表达量随药物浓度的增加而逐渐增加;浓度为3~6 mg/L时,Tet(X)基因相对表达量随药物浓度的增加而逐渐降低.[结论]Tet(X)可有效提高宿主菌株对四环素类药物的耐受性,在一定的四环素类药物剂量范围内可诱导Tet(X)基因表达.不同鸭疫里默氏杆菌Tet(X)基因具有不同来源,说明Tet(X)可能存在基因水平转移,且具有环境扩散的风险.     

6种血清型鸭疫里默氏菌SSPA基因的克隆及序列分析

为了解鸭疫里默氏菌SSPA基因的生物学信息,参照GenBank登录的鸭疫里默氏菌SSPA基因序列设计了1对特异性引物,成功克隆6种血清型鸭疫里默氏菌SSPA基因,并利用生物信息学软件DNAstar及在线分析工具SignalP V4.0、TM-HMM Server V.2.0、NetNGly c1.0、YinOYang 1.0和NetPhos 2.0对推导的氨基酸序列进行分析。结果显示:该基因的ORF全长1 692bp,可编码563个氨基酸;氨基酸序列含有1个潜在的N-糖基化位点,1个潜在的O-糖基化位点,以及38个潜在的磷酸化位点(包括12个丝氨酸、9个苏氨酸和17个酪氨酸位点),无跨膜区;该蛋白信号肽切割部位位于第19位的A(丙氨酸)和第20位的Q(谷氨酰胺)之间;6种血清型鸭疫里默氏菌SSPA基因的核苷酸同源性为95.7%~100.0%,氨基酸同源性为98.2%~100.0%。     

感染鸭疫里默氏菌对鸭小肠黏膜形态结构的影响

为了解感染鸭疫里默氏菌后鸭肠道形态结构的变化,采用石蜡切片、HE染色方法测定鸭感染鸭疫里默氏菌1、2、3、5、9、14 d十二指肠、空肠和回肠3个小肠段肠黏膜厚度、肠绒毛高度和隐窝深度,并计算绒毛高度和隐窝深度比值。结果表明,与对照组相比,在感染鸭疫里默氏菌1～9 d后,鸭的十二指肠、空肠和回肠肠黏膜厚度和肠绒毛高度变化一致,均表现为明显下降;隐窝深度在3个小肠段的变化不同;肠绒毛高度/隐窝深度的值在感染鸭疫里默氏菌的3个小肠段中总体均呈下降趋势。说明感染鸭疫里默氏菌显著影响了鸭小肠形态结构,该研究为鸭疫里默氏菌的致病机制研究奠定了基础。     

鸭疫里默氏菌2型分离鉴定及药敏试验

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的危害雏鸭的一种急性或慢性败血性传染病。其中以鸭疫里默氏菌2型对我国养鸭场造成的危害最大。本试验通过从山东、广西、四川等地分离的20株2型鸭疫里默氏菌分离株的生理生化、药敏试验发现:这20株2型菌分离株其生理生化特性一致;分离株表现不同程度的耐药性,对头孢噻肟钠、氟苯尼考、绿都肠乐、罗红霉素、阿奇霉素和阿莫西林敏感度较高。将20株分离菌株培养物分别接种15日龄健康雏鸭,每只颈部皮下注射1.0×106CFU/ml,观察10天。结果表明:20株分离株对15日龄雏鸭致病性差异较大,致死率从0到100%不等,其中sd-5株致病性最强,致死率为100%;其次分别为sd-4(致死率80%)和hy-2(致死率70%)。     

1、2型鸭疫里默氏菌外膜蛋白分析

采用超声波裂解和超速离心法提取30株鸭疫里默氏菌(Ra,1型和2型各15株)的外膜蛋白(OMP),经SDSPAGE凝胶电泳分析,以上2个血清型Ra的OMP均由13个蛋白多肽组成,其分子质量大小为20-100ku,相同血清型的电泳图谱相似,不同血清型的电泳图谱差异较大.经软件分析,1型RaOMP的主要条带有5条,其分子质量分别为95.0、87.7、73.2、55.4、49.8ku,占OMP总量的60.1%;2型RaOMP的主要条带有4条,其分子质量分别为95.5、53.1、50.0、22.4ku,占OMP总量的62.6%.2个血清型菌株有10个蛋白多肽的分子质量大小相似,但含量不同,另有3个蛋白多肽的分子质量差异明显.     

鸭疫里默氏菌多价疫苗研究进展及其效力检测方法

鸭疫里默氏菌病对鸭类养殖业造成严重危害,总结鸭疫里默氏菌多价疫苗的研究进展和效力检测方法,阐述多价疫苗的构建、免疫效果评价等方面的研究进展,旨在为鸭疫里默氏菌多价疫苗的研究与应用提供参考。     

鸭疫里默氏杆菌ERIC-PCR基因分型

为了解广东地区鸭疫里默氏杆菌的流行情况,采用经优化建立的ERIC-PCR分型方法对来自广东地区16个鸭场的48株鸭疫里默氏杆菌分离株进行基因分型。结果表明:用ERIC-PCR法可将48个分离株分为16个基因型。12个鸭场存在着两种或两种以上基因型的菌株,并且不同鸭场流行基因型不同,8型和11型是较为流行的菌株。该研究结果可为广东地区鸭疫里默氏杆菌病的免疫防治提供参考。     

1型和2型鸭疫里默氏菌的交叉保护

通过PCR扩增、克隆、序列测定获得29株鸭疫里默氏菌(RA)的16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区的核苷酸序列.将16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列连接后分析发现,1型菌株和大多数2型菌株分别处于不同的分支,而2型菌株中的RAf11、RAf3和RAf104不处在2型菌株的分支中,却与1型菌株非常接近.挑选RAf11菌株和2型分支中的RAf19菌株,分别制备灭活苗,免疫雏鸭后进行攻菌保护试验,RAf11菌株对1型菌株的攻击可产生较高的交叉保护率,达53.8%,而RAf19菌株对1型菌株攻击的保护率仅为23.1%.借助16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列的分析,筛选到一株具交叉保护的RA菌株.     

鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮药物的主动外排作用

为研究鸭疫里默氏菌对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等氟喹诺酮类药物的主动外排机制,测定25株鸭疫里默氏菌临床分离株对氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度（M IC ）,同时测定加入主动外排抑制剂碳酰氰间氯苯腙（CCCP）后的MIC ,对二者进行比较分析。结果表明,对5种氟喹诺酮类药物耐药的鸭疫里默氏菌比例分别为84％、72％、76％、68％和36％;76％的菌株同时耐受2种及以上药物。CCCP可以使耐药菌对除左氧氟沙星外药物的敏感性增加,提示主动外排在鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制中发挥重要的作用。     

鸭疫里默氏菌感染对鸭生长发育及肠黏膜屏障功能的影响

为了为鸭疫里默氏菌与机体的相互作用及作用机制研究提供基础数据,以雏鸭为研究对象,开展鸭人工感染鸭疫里默氏菌试验,分别测定感染组和对照组1、2、3、5、9、14 d等不同时间段的体质量、小肠各肠段的长度以及血浆中内毒素和血清中乳酸脱氢酶含量;荧光定量PCR法检测肠黏膜屏障功能相关基因MUC2和MYLK的表达量,探讨鸭疫里默氏菌感染对鸭生长发育和肠黏膜屏障功能的影响。结果表明,与对照组相比,感染组5、9 d体质量显著降低;感染鸭疫里默氏菌5 d十二指肠和空肠的长度显著降低;感染鸭疫里默氏菌1 d血浆中内毒素和血清中乳酸脱氢酶的含量均显著增加;鸭人工感染鸭疫里默氏菌的MUC2和MYLK表达量在十二指肠和空肠主要表现为下调,而在回肠MUC2的表达量表现为先下降再上调,MYLK的表达量表现为先下调再恢复至对照水平。综上,鸭人工感染鸭疫里默氏菌会减缓鸭的体质量增长和小肠生长,引起鸭的肠黏膜屏障功能相关基因的表达发生变化。     

美国绿头野鸭鸭疫里默氏菌病的诊断与防制

介绍美国绿头野鸭鸭疫里默氏菌病的病原、临床症状、病理变化和实验室诊断方法,并总结其防制措施,以为美国绿头野鸭的养殖提供参考。     

3株鸭疫里默氏菌血清型鉴定及其生化特性的比较

从临床剖检表现为典型纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎的病死雏番鸭和雏半番鸭中分离到３株菌－Ｆ９８０６２、Ｆ９８０７３、Ｆ９８０７４．根据培养特性、形态观察、染色特性及血清型鉴定均血清Ⅱ鸭疫里默氏菌、将以上３ 里默氏菌按常规方法进行生化特性的测定,结果表明同一血清Ⅱ型的三株不同鸭疫里默氏菌,其生化特性不尽相同。     

3株鸭疫里默氏菌血清型鉴定及其生化特性的比较

从临床剖检表现为典型纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎的病死雏番鸭和雏半番鸭中分离到 3株菌— F980 6 2、F980 73、F980 74 .根据培养特性、形态观察、染色特性及血清型鉴定均为血清 型鸭疫里默氏菌 .将以上 3株鸭疫里默氏菌按常规方法进行生化特性的测定 .结果表明同一血清 型的三株不同鸭疫里默氏菌 ,其生化特性不尽相同     

四川地区鸭疫里默菌的分离与鉴定

为了研究鸭疫里默菌的生物学特性及其发病机制,从四川地区某鸭场临床症状、剖检病变疑似鸭疫里魔菌病例进行细菌分离,从中分离到1株细菌。对分离的病菌进行形态培养、生化试验、动物试验和琼扩试验,鉴定为鸭疫里默菌。药敏实验表明鸭疫里默菌对头孢噻肟、卡那霉素、环丙沙星等敏感性较高。     

鸭疫里默菌河南株的分离与鉴定

为了研究鸭疫里默菌的生物学特性及其发病机制,从河南地区某鸭场临床症状、剖检病变疑似鸭疫里默菌病例进行细菌分离,从中分离到1株细菌。对分离的病菌进行形态培养、生化试验、动物试验、琼扩试验和血清型鉴定,鉴定为鸭疫里默菌3型。药敏实验表明鸭疫里默菌对头孢噻肟、卡那霉素、环丙沙星等敏感性较高。