杜仲糖基转移酶基因EuCGT1克隆及序列分析

本研究以杜仲(Eucommia ulmoides)7月雌株新生幼枝的树皮为材料,根据杜仲转录组测序数据中筛选的一个糖基转移酶基因(CGT)片段信息设计引物,采用SMART RACE技术,克隆了5’-端1432bp和3’-端535 bp cDNA片段,测序拼接后获得全长1 583 bp的杜仲CGT的cDNA序列。分析结果表明,该cDNA开放阅读框长1 464 bp,编码487个氨基酸,命名为EuGT基因。EuGT在NCBI中经blastn比对,显示序列与甜橙和草莓的UDP-葡萄糖基转移酶基因同源性分别为72%和67%;推测的氨基酸序列经blastp和CDD比对,显示序列与UDP-葡萄糖类黄酮3-O-糖基转移酶-6同源,其中含有UDP-葡萄糖基转移酶的保守域(pfam00201),初步推测EuCGT1蛋白属于糖基转移酶家族。本研究克隆的EuGT基因是首次从杜仲中克隆的糖基转移酶家族基因。以EuCGT1基因构建的植物表达载体pSH-35S-EuCGT1采用农杆菌介导法遗传转化烟草,获得了含EuCGT1基因的转基因烟株,移栽生长1个月的转基因烟草植株在表型上与野生型烟草无明显差异。     

蜡状芽孢杆菌环糊精糖基转移酶的基因克隆表达·酶学特性及定点突变研究

研究克隆、表达了蜡状芽孢杆菌来源的环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase,EC 2.4.1.19)基因,研究了其酶学性质,并在此基础上构建突变菌株以探究关键氨基酸位点与产物特异性的关系。结果表明,重组CGTase的最大比活力达5 292 U/mL,分子量约为68 kDa,最适温度和pH分别为55℃和8.5;以淀粉为底物催化合成的主要产物是β-环糊精(β-CD);通过序列对比选取了第47位氨基酸(Ala)进行定点突变,构建了A47R、A47M、A47S、A47Y。研究发现活性区域中第47位氨基酸对于产物特异性和产量具有一定的影响,其中亲水性氨基酸更利于CDs(尤其β-CD)的合成,这为酶法合成β-CD的工业应用提供了方法。     

梭梭液泡膜焦磷酸酶HaVVP基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物液泡膜焦磷酸酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到1个H+-PPase基因,命名为HaVVP。HaVVP基因编码区长2 734bp,编码767个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的高等植物H+-PPase基因核苷酸序列的同源性均在68%以上、氨基酸序列的同源性达80%以上。     

茄花青素5-O糖基转移酶基因克隆与表达特征分析

以云南长紫茄果皮为实验材料,采用同源克隆技术和RACE结合的方法,克隆到茄子花青素5-O糖基转移酶基因(5GT).该基因编码区为1 413 bp,与矮牵牛5GT基因序列同源性为87.4％.花青素含量测定和半定量PCR结果表明,该基因在云南紫长茄的花瓣和成熟果皮中的表达量要高于云南圆白茄;而在叶片和未成熟果皮中,2个品种...     

白桦木聚糖内糖基转移酶XET基因序列及表达

从白桦(Betula platyphylla Suk.)形成层相关组织cDNA文库中获得一个木聚糖内糖基转移酶XET基因全长cDNA序列,其ORF全长882 bp,编码由293个氨基酸残基组成的多肽,编码蛋白的分子质量为33.1 ku,理论等电点为5.49。运用生物信息学方法对该蛋白进行理化性质分析及保守区预测,确定其属于糖基水解酶16超家族;进一步模拟蛋白空间结构,得到了可靠的分子生物学模型;利用sqRT-PCR分析白桦组培苗不同器官内XET基因的表达情况,结果显示XET在发育中的根茎叶内都有较高的表达水平。     

木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因克隆与序列分析

【目的】克隆木纳格葡萄果实中谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)基因VvGST1全长并研究其序列特征,为该基因在葡萄果实抗病作用和功能的研究奠定基础。【方法】根据已有的基因序列,设计3’和5’端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆VvGST1基因cDNA全长。【结果】该基因序列全长719 bp,均为开放阅读框(ORF),共编码221个氨基酸。该基因编码蛋白相对分子质量为25.55 kDa;理论等电点pI值为6.32;分子式为C₁₁₇₈H₁₇₉₉N₂₉₃O₃₂₁S₁₁;不稳定指数为39.22;该蛋白质是稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,没有预测到信号肽,可能存在于细胞基质中,是典型的基质蛋白。VvGST1氨基酸序列与棉花、桃、西梅、樱桃、李子、板栗等植物聚为一类,其中与棉花属亲缘关系最近。【结论】获得了木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因全长编码序列,探明了该序列的结构特征。     

紫化茶树UDP-糖基转移酶启动子的克隆及其生物信息学分析

以紫化茶树武夷奇种C18的叶片为材料,采用染色体步移技术获得该材料的UDP-糖基转移酶(UDPG)基因5′端上游启动子序列大小为902 bp,利用软件进行生物信息学分析.结果表明,该调控序列含有启动子核心元件TATA-box、CAAT-motif以及多个光响应元件(GT1-motif、GATA-motif等)、胚乳特异性表达元件(GCN4-motif、Skn-1-motif)、水杨酸响应元件(TCA-element)等特殊顺式作用元件.     

森林草莓糖基转移酶基因家族生物信息学及其表达分析

【目的】对森林草莓糖基转移酶基因（FvUGT）家族进行生物信息学分析及基因表达分析,为深入研究森林草莓UGT基因功能和探索UGT调控草莓果实发育及花色苷及品质形成提供理论依据。【方法】基于Phytozome数据库鉴定得出138个FvUGT基因家族基因,运用生物信息学方法分析其蛋白理化性质、基因结构、保守结构域和进化关系,并采用实时荧光定量PCR对UFGT候选基因在森林草莓（红果和白果2个类型）各组织（根、叶柄、叶和果实）中的表达量进行分析。【结果】FvUGT基因家族可分为12个类群（A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N）,每个类群分别包含16、2、23、32、8、1、5、5、7、3、21和4个成员;染色体定位发现FvUGT基因家族成员在除2号染色体之外的其他染色体上均有分布,且分布不均;FvUGT基因内含子长度、外显子位置和数目在不同成员间均存在差异,FvUGT基因家族在进化过程中产生较强的分化。实时荧光定量PCR检测结果表明,FvUFGT70基因在森林草莓白果和红果的叶和叶柄中有较高表达;FvUFGT94基因在各组织中均有表达;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有较高表达;而FvUFGT95和FvUFGT96基因在果实中有表达,且显著高于其他组织（P<0.05,下同）。同时,在果实的小绿期、转色期和成熟期的表达表现为,成熟期FvUFGT33和FvUFGT95这2个基因在森林草莓红果类型的表达量显著高于白果类型。【结论】7个FvUFGT基因表现出明显的组织差异性,其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果实中有较高表达量,且在森林草莓红果类型表达量显著高于白果类型,故推测其在花色苷合成中发挥作用。     

大豆类黄酮糖基转移酶基因UGT73C19的功能研究

【背景】 类黄酮是大豆中积累的一类重要的植物次生代谢产物,参与大豆的生长、发育和抗逆等诸多生理活动。由UDP-糖基转移酶（UGT）催化的糖基化修饰是类黄酮生物合成的关键步骤。【目的】 通过系统研究大豆UGT73C19编码重组酶的体外酶活特性和体内特性,完善大豆黄酮类化合物合成和积累的机制,为大豆品质的遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】 通过高效液相色谱（HPLC）的方法检测大豆核心种质资源叶片中类黄酮的种类和含量,通过qRT-PCR的方法检测了UGT的表达水平。以大豆Williams 82叶片cDNA为模板,克隆得到UGT73C19的编码区序列。使用MEGA5和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建进化树。通过原核表达系统获得UGT73C19的重组蛋白,分析UGT73C19重组蛋白对各种类黄酮苷元的糖基转移活性,并通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对产物进行鉴定,确定重组蛋白的糖基化位点。利用qRT-PCR技术对UGT73C19在大豆不同组织的表达水平进行分析。构建植物过量表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,获得UGT73C19表达量高的纯合株系,检测转基因株系叶片和种子中类黄酮的种类和含量。【结果】 通过HPLC分析大豆核心种质资源叶片类黄酮成分,发现不同品种中类黄酮的成分和含量存在明显差异。根据类黄酮成分的不同,将大豆核心种质分为12种不同的类型。大豆核心种质资源叶片中总黄酮的含量与UGT73C19的表达水平呈正相关关系。克隆得到UGT73C19的编码区序列,全长1 482 bp,编码493个氨基酸,UGT73C19蛋白在C-端有一个保守的PSPG结构域。体外酶活分析表明,重组的UGT73C19蛋白对6种类黄酮苷元（山奈酚、槲皮素、杨梅素、芹黄素、大豆苷元和染料木素）都具有糖基转移活性,其中对槲皮素的催化效率最高;糖基化位点分别位于类黄酮的5位和7位羟基上,重组UGT73C19蛋白的糖基化底物和位点具有多样性。过量表达UGT73C19的拟南芥叶片和种子中的类黄酮总量明显升高,其中叶片中总黄酮含量提高49%—70%,种子中总黄酮的含量提高34%—37%;尤其是种子中槲皮素3-O鼠李糖的含量显著增加。【结论】 UGT73C19蛋白是催化合成大豆中多个类黄酮糖苷的关键糖基转移酶,过量表达UGT73C19可以提高转基因植物中黄酮醇糖苷和类黄酮的含量。     

梭梭VHA B基因克隆及序列分析

采用RT PCR和RACE法从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中扩增出VHA B基因cDNA序列，其开放阅读框为1 413 bp，推测编码全长为471个氨基酸残基的氨基酸序列，该蛋白分子量约为52.304 ku，等电点为5.08。运用SMART、DNAMAN、GOR4、TMPred等生物信息学软件对梭梭VHA B功能域、跨膜结构进行分析显示，梭梭VHA B含有3个ATP synt_ab_N 、ATP synt_ab、ATP synt_ab_C结构域，但是不含跨膜结构域和信号肽。氨基酸序列同源性结果显示，HaVHA B与盐爪爪、盐穗木、碱蓬等同源性高达89.68%。说明VHA B基因是一个高度保守基因。     

梭梭过氧还蛋白基因（PrxQ）克隆与序列分析

采用RT-PCR、RACE方法从超旱生、耐盐植物梭梭中扩增出PrxQ基因cDNA序列,该序列全长966bp,包含654bp的开放阅读框,推测氨基酸序列全长为218个氨基酸残基,该蛋白分子量为24 106.0,等电点为9.78,含有2个保守的Cys残基。序列同源性分析结果显示,核苷酸序列与藜科几种盐生植物如碱蓬等的同源性为70.01%,与其他植物佛甲草等的同源性为55.30%。说明,PrxQ基因在藜科盐生植物中是一种较高保守的基因。     

梭梭 HaNAC20基因克隆及特性分析

为深入分析 HaNAC20转录因子在梭梭抗逆机制中的作用,以梭梭［Haloxylon ammodendron(C.A.Mey.) Bunge］ HaNAC20转录因子为对象,克隆其编码基因,对其基本理化性质、所属亚族及同源基因进行生物信息学分析,使用qRT-PCR方法对 HaNAC20在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下的表达量进行分析,构建表达载体,进行亚细胞定位及转录激活活性分析。结果表明：克隆得到1个编码区全长为822 bp的梭梭NAC转录因子家族基因,命名为 HaNAC20(登录号：KU845314),编码273个氨基酸。系统发育树显示 HaNAC20属于NAC家族中与非生物胁迫相关的SNAC亚族。核定位信号预测及亚细胞定位结果表明 HaNAC20定位于细胞核内。表达量分析结果显示：在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下, HaNAC20表达量均显著上调。转录激活分析结果显示该转录因子C端具有转录激活活性。表明 HaNAC20基因在梭梭响应非生物逆境胁迫、提高梭梭抗逆性中发挥重要作用。     

梭梭ARF1基因的克隆及序列分析

二磷酸腺苷-核糖基化作用因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)属小G蛋白超级家族中的Arf亚族,是真核细胞囊泡运输通道的关键组成成分,参与细胞运输和信号传导。本试验采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中扩增出ADP-ribosylation factor(ARF1)基因的cD-NA序列(命名为HaARF1),其开放阅读框为546bp,推测氨基酸序列全长为181个氨基酸残基,具有典型的小GTP结合蛋白结构域。其氨基酸序列与GenBank中已发表同源对比相似度达99%以上,表明ARF1基因在不同物种间高度保守。     

梨小食心虫actin基因全长cDNA克隆与序列分析

为梨小食心虫其他基因表达调控研究提供内参基因以及actin基因的研究,运用RT-PCR和RACE技术,克隆获得梨小食心虫actin基因全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因cDNA序列全长为1 451bp,其中包括67bp的5′非编码区、253bp的3′非编码区和1 131bp的开放性阅读框,编码376个氨基酸。该蛋白预测分子质量为41.776 8ku,等电点为5.22,氨基酸序列中有6类功能位点,具有actin家族典型特征,与其他昆虫actin氨基酸序列高度同源,达97%~99%。成功克隆梨小食心虫actin基因全长cDNA,该序列已提交GenBank,登录号为KF022227。     

罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析

为了解罗布麻査尔酮合成酶基因具体结构,采用RT-PCR、RACE方法从夹竹桃科植物罗布麻中扩增出CHS基因的开放阅读框,其核苷酸序列长1 170bp,推测的氨基酸序列全长为389个氨基酸残基。核苷酸序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与其他植物CHS基因的同源性为78%~81%,表明该基因在进化过程中变异程度较小,整个超基因家族序列高度保守。     

偏肿革裥菌漆酶基因克隆及启动子序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,通过RT-PCR和RACE技术相结合,从偏肿革裥菌 Lenzites gibbosa 菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2 165 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子.cDNA序列的全长为1 873 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1 563 bp,编码520个氨基酸.序列在氨基酸水平上与彩绒革盖菌 Trametes versicolor 的相似性评价最高,相似性达83%.通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长986 bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括7个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、7个氮因子结合位点等.这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节偏肿革裥菌漆酶基因的表达.     

梭梭EF hand CaBP基因克隆及序列分析

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中扩增出EF-handCaBP(EF-hand calcium-binding protein)基因的cDNA序列(GenBank登录号为JQ023165),其开放阅读框为732bp,推测的氨基酸序列全长为243个氨基酸残基。运用SMART、GOR4、TMPred等生物信息学软件对梭梭EF-hand CaBP功能域、跨膜结构进行分析显示,梭梭EF-hand CaBP含有26个氨基酸的信号肽序列及4个保守的钙结合位点(EF-hand),并且存在2种跨膜模型,推测梭梭EF-hand CaBP基因可能定位于液泡膜或叶绿体膜上。     

甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。