麦洼牦牛和九龙牦牛乳蛋白遗传多态性的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对109头麦洼牦牛和100头九龙牦牛乳蛋白多态性进行分型，并采用最小二乘法分析乳蛋白多态性与泌乳性能及乳蛋白组分之间的相关性。结果表明：β-CN、κ-CN和α-La呈单态，基因型分别为AA、BB和BB型；而αs1-CN和β—Lg呈多态，αs1-CN D基因为优势基因，在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0．8073和0．600O，β—Lg座位优势基因为β-Lg E，在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为O．977O和O．970O；麦洼牦牛和九龙牦牛群体平均杂合度分别为0．1021和0．1867；在2个品种牦牛群体中，除αs1-CN基因座对九龙牦牛乳脂率有显著影响外，其余乳蛋白基因座对泌乳性能及乳蛋白相对百分含量均无显著影响。     

奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。     

脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞条件的优化

[目的]优化脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞的条件。[方法]通过胶原酶消化法和组织块贴壁法,体外分离培养得到牦牛乳腺上皮细胞。采用免疫细胞化学技术检测细胞角蛋白在细胞内的表达。以绿色荧光蛋白为报告基因,通过脂质体介导外源基因转染牦牛乳腺上皮细胞,统计在不同细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间下的转染效率,寻求最佳转染条件。[结果]牦牛乳腺上皮细胞在细胞融合度为81%～90%,脂质体的量为1.8μl,脂质体与质粒比例为2∶1,转染时间为4h时,转染效率最高。[结论]该研究可为乳腺生物反应器构建提供试验依据。     

脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞条件的优化(英文)

[目的]优化脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞的条件。[方法]通过胶原酶消化法和组织块贴壁法,体外分离培养得到牦牛乳腺上皮细胞。采用免疫细胞化学技术检测细胞角蛋白在细胞内的表达。以绿色荧光蛋白为报告基因,通过脂质体介导外源基因转染牦牛乳腺上皮细胞,统计在不同细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间下的转染效率,寻求最佳转染条件。[结果]采用胶原酶消化法,24h内细胞团块贴壁生长,纤维样细胞沿着细胞团块生长,后上皮样细胞爬出。上皮细胞与纤维细胞界限明显,细胞呈椭圆形,排列紧密,岛屿状生长。纯化至5代左右可得到较纯的上皮样细胞。采用组织块贴壁法,6d左右组织块周围出现细胞晕,有少量纤维样细胞生长;8d左右,上皮样细胞长出,并往外不断铺展。在荧光显微镜下观察,试验组细胞角蛋白检测呈阳性,细胞质呈绿色,细胞核复染呈红色。牦牛乳腺上皮细胞在细胞融合度为81%～90%,脂质体的量为1.8μl,脂质体与质粒比例为2∶1,转染时间为4h时,转染效率最高。[结论]该研究可为乳腺生物反应器构建提供试验依据。     

牦牛致病性大肠杆菌生物学特性研究

对牦牛致病性大肠杆菌的某些生物学特性进行了研究，包括分离菌株血清学特性，溶血性，血凝性，菌毛的表达，对小鼠，兔的致病性及抗生素敏感性等，结果表明，该菌株血清型属O148，为国内外首次报道，不产生溶血素，对绵羊，豚鼠，马，鸡的红细胞表现强凝集，而对猪，兔的红细胞不凝集，血凝能被D－甘露糖抑制，表现为MSHA，在营养肉汤中经37度，48h培养表达菌毛，肌肉接种兔，腹腔接种小白鼠均具有高致病性，分离菌株对恩诺沙星，环丙沙星，阿莫西林，羧苄青霉素等高度敏感，而对青霉素，四环素，土霉素，氯霉素等表现耐药性。     

麦洼牦牛SMPX基因多态性及其与生长性状的关联分析

[目的]本研究旨在探讨SMPX基因在麦洼牦牛中的遗传多态性,并筛选其SNP位点,分析突变位点不同基因型与其生长性状的相关性,为牦牛优良性状定向选育提供依据.[方法]以89头健康成年的麦洼牦牛为试验材料,采用DNA混合池技术辅以直接测序法筛选候选基因的SNPs,同时利用SPSS 19.0软件对不同基因型与牦牛生长性状进行...     

麦洼牦牛TLR1基因组织表达分析

【目的】建立一种牦牛TLR1基因表达量的荧光定量PCR检测方法,并分析TLR1基因在牦牛不同组织中的表达差异。【方法】参考牦牛TLR1基因序列,在其保守区设计特异性引物,并以牦牛β-actin基因为内参基因建立荧光定量方法;基于该荧光定量方法分析TLR1基因在牦牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、乳腺、肌肉、卵巢11种组织中的表达水平。【结果】TLR1基因和β-actin基因扩增产物电泳结果呈现单一条带,其产物熔解曲线均为特异的单峰,表明引物具有较高的特异性。组织表达结果显示,TLR1基因在所检测的牦牛11个组织样本中均有表达,其中在肾、肝、脾、肺、卵巢、小肠中表达量较高,在胃、乳腺、心、大肠、肌肉组织中表达量较低。【结论】TLR1基因在牦牛各组织中转录水平差异较大,这可能与各组织对病原体的识别和抵抗能力有关。     

麦洼牦牛群体4个新微卫星位点遗传多态性分析

【目的】利用4个新分离的牦牛基因组多态微卫星位点,分析麦洼牦牛的遗传多态性及群体的遗传分化特征。【方法】以130个麦洼牦牛个体基因组DNA为模板,PCR扩增Bogr203、Bogr204、Bogr205和Bogr215 4个微卫星位点序列,通过测序进行基因分型,根据基因型计算各个位点的多态性,并推断麦洼牦牛群体的遗传分化特征。【结果】麦洼牦牛群体在4个微卫星位点具有较高的遗传多态性,平均观察杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和平均多态信息含量(PIC)分别达到0.626,0.800和0.751;通过Structure软件能够较明确地将麦洼牦牛群体区分为2个亚群,这与麦洼牦牛分布地域广泛有较大关系,但各个亚群的牦牛个体及其分布区域还需要进一步研究。【结论】麦洼牦牛品种具有较高的遗传多态性,并可能分化为至少2个亚群。     

山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立

为研究乳腺上皮细胞增殖和分化特性及其基因表达的分子机制 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。用无菌手术法从健康第二胎泌乳期山羊乳腺取得组织块 ,在体外条件下用组织块法进行原代培养。基础培养液用 RPMI1 6 4 0 ,含胎牛血清 1 5 0 m L/ L,添加 EGF(1 0 μg/ L)、胰岛素 (0 .1 m g/ L)、E2 (1 μg/ L)、氢化可的松 (0 .1mg/ L)、孕酮 (1 m g/ L)、青霉素 (0 .1 g/ L)及链霉素 (0 .0 5 g/ L) ,在铺有胶原的塑料培养板上培养。从细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 4个方面考察了乳腺上皮细胞的生物学性状。结果表明 ,在此培养体系中 ,山羊乳腺上皮细胞生长良好 ,增殖旺盛。细胞产物电泳及蛋白印迹分析结果表明 ,培养的细胞为山羊乳腺上皮细胞 ,并具有表达山羊酪蛋白的功能     

Induced in vitro Expression of Human Lactoferrin in Goat Mammary Gland Epithelial Cell

[Objective]The aim of this study was to explore the technical system of induced expression in vitro of goat mammary gland epithelial cell,and evaluate expression efficiency of mammary gland specific vector and foreign protein at the cell level.[Method]Goat mammary gland epithelial cell transfected by human lactoferrin gene was inducted by culturing in DMEM/F12 medium supplemented with 5 mg/L insulin,5 mg/L prolactin and 1 mg/L hydrocortisone.Supernatant was collected per 6 hours and concentrated.Expression situation of foreign protein were detected by SDS-PAGE and Western blotting.[Result]There was target protein expression in the induced culture medium,which molecular weight was about 42 kD.[Conclusion]The method used in this study can induce goat mammary gland epithelial cell to express foreign gene,it lays a foundation for researching heterologous expression of foreign gene and producing mammary gland bioreactor.     

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的体外诱导表达

[目的]为了探索山羊乳腺上皮细胞体外诱导表达的技术体系,评价乳腺特异性载体效率及外源蛋白在细胞水平的表达情况。[方法]用含5mg/L胰岛素、5mg/L催乳素、1mg/L氢化可的松的DMEM/F12培养液对转染人乳铁蛋白基因的山羊乳腺上皮细胞进行体外诱导培养,每6h收集1次上清液。上清液浓缩后分别用SDS-PAGE和Westernblot检测外源蛋白的表达情况。[结果]诱导培养液中有目的蛋白表达,分子量约为42kD。[结论]该研究所用的山羊乳腺细胞诱导表达方法能够诱导山羊乳腺上皮细胞表达外源基因,这为人乳铁蛋白基因的异源表达与乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

人溶菌酶基因真核表达载体构建及其在牛乳腺上皮细胞中的表达

构建真核表达载体pEGFP-C1-hLYZ,并从基因水平研究人溶菌酶基因在体外培养的牛乳腺上皮细胞中的表达,为核移植提供转基因供体细胞.采用PCR的方法从人溶菌酶质粒中扩增854 bp人溶菌酶基因(包括完整的编码框446 bp).并克隆到pMD18-T载体上,用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切.将人溶菌酶基因的酶切片段(883 bp)定向克隆到pEGFP-C1的多克隆位点中,构建重组表达质粒pEGFP-hLYZ,并进行Hind Ⅲ和Bam HI双酶切鉴定.转染体外培养的牛乳腺上皮细胞,48 h后观察其表达情况.PCR检测溶菌酶基因的表达.成功构建了人溶菌酶真核表达载体,观察到表达绿色荧光蛋白的牛乳腺上皮细胞,并检测到溶菌酶基因.     

microRNA在调节乳腺发育和乳腺免疫功能中的作用

miRNAs分子是除了激素之外对乳腺发育以及乳腺免疫功能进行调控的重要分子,综述了miRNAs在乳腺发育以及乳腺免疫中的最新研究进展。     

太湖猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

以太湖猪皮肤为材料,采用组织块法培养成纤维细胞,并对其进行生物学特性检测,包括细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后接种的存活率测定、生长曲线绘制、染色体核型分析。结果表明:所培养的成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后接种的存活率分别为96·5%和93·2%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为72h;对所制备的染色体片核型分析显示2n=38,XY。本次实验成功地建立了太湖猪成纤维细胞系,为在细胞水平上保存太湖猪种质资源提供了可能,并为其他研究提供了实验材料。     

Construction of Antibacterial Peptide CecropinB Eukaryotic Recombinant Vector and Its Expression in Dairy Goat Mammary Gland Epithelial Cells

To investigate the expression of antibacterial peptide CecropinB cDNA in dairy goat mammary gland epithelial cells,the CecropinB gene was cloned and was inserted into a eukaryotic vector pECFP-C1 to construct the recombinant plasmid pECFP-B by genetic engineering technique.Recombinant plasmid pECFP-B was transfected into dairy goat mammary gland epithelial to detect the bactericidal activity of CecropinB.The expression of CecropinB was also detected.The result of RT-PCR demonstrated CecropinB gene was expressed in transfected cells.CecropinB recombinant plasmid DNA was injected into udders and CecropinB was expressed in mammary gland,exhibiting bactericidal activity to Staphylococcus aureus in vivo experiments.     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立

通过乳汁中提取细胞进行传代培养获得增殖且可分泌特异性酪蛋白的奶牛乳腺上皮细胞,细胞形态以鹅卵石型和多角型为主,逐渐趋于多角型.当多角型细胞增殖融合到一定阶段,会出现乳头状和圆顶型结构.并进一步对泌乳中后期乳汁分离的细胞做细胞生物学性状检测:细胞接种存活率达到81;;细胞生长曲线呈典型的"S"形,符合细胞生长的一般生物学规律;细胞群体倍增时间最短达48.7 h;经过对乳腺上皮细胞特异性分泌蛋白-酪蛋白的检测,证明培养获得的细胞为乳腺上皮细胞,且具有正常分泌乳蛋白功能.试验初步建立了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系.     

太行黑山羊成纤维细胞系建立与生物学特性研究

以太行黑山羊耳缘组织为材料,采用组织块直接培养法和细胞冷冻技术构建了成纤维细胞系,并进行了细胞活力测定生长动力学观察、微生物污染间检测、染色体标本制备、同功酶分析及生物学研究。结果表明：细胞群体倍增时间（PDT）约为24h;细胞染色体中二倍体（2n=60）占主体,镜检细胞的百分比为98．2％;乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸（MDH）脱氢酶同工酶分析,没有其他物种污染;细菌、真菌、病毒、支原体检测阴性。该细胞库的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准。此项研究不仅在细胞水平上保存了这一重要畜禽品种的种质资源,而且亦为其基因组和后基因组及体细胞克隆等研究提供宝贵实验材料。同时,此技术平台的建立必将为其他畜禽遗传资源细胞水平的保存提供技术与理论支撑和保障。     

牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究

建立可用于基因打靶的乳腺上皮细胞系是乳腺生物反应器研制的重要环节,分别采用胰蛋白酶、胶原酶及其两者的混合消化液分离获得了包括少量成纤维细胞在内的原代牛乳腺上皮细胞,比较了不同消化方法的优缺点。利用Trypsin-EDTA阶段消化法在体外培养牛乳腺上皮细胞,观察了此细胞培养到第5代、10代、15代和20代时的细胞形态特征和生长特性,比较了该细胞在胶原基质和混合型基质包被培养皿中的培养效果。以乳腺腺泡上皮细胞中的细胞特征蛋白角蛋白18为标志,利用角蛋白18单克隆抗体进行了细胞免疫组化鉴定,证明分离培养细胞的上皮特性。     

小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展

综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程,并分析了所取得的研究成果。