牙鲆肌肉生长抑素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑素（MSTN）基因。经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸。5`侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3`侧翼区含有加尾信号。通过同源分析,牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支。RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控。     

肌肉生长抑制素(myostatin MSTN)基因的研究进展

本文综述了肌肉生长抑制素(myostatinMSTN)基因的家族成员、功能、结构、作用机制、同源性、定位、部分位点及表达,并对MSTN基因的研究前景进行了展望。     

泥鳅肌肉生长抑制素基因片断的克隆及其表达

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）是动物肌肉生长发育的负调控因子。以泥鳅肌肉cDNA为模板,采用RT-PCR法克隆了泥鳅MSTN基因的主要片段,其长度为815 bp,编码271个氨基酸残基。泥鳅MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和保守的半胱氨酸残基。RT-PCR分析表明该基因在肌肉中显著表达,在眼中也有微弱表达,而在其他所检测组织（脑、鳃、心脏、肝脏、肠、精巢、卵巢）未见表达。此结果表明泥鳅MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,还可能在眼的发育中有一定作用     

淇河鲫肌肉生长抑制素基因的克隆与表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子。为了明确淇河鲫MSTN基因序列及其在肌肉生长发育中的调控功能,本研究利用RACE方法克隆淇河鲫MSTN全长c DNA序列,q RT-PCR分析其在不同组织和胚胎发育阶段的表达情况。结果显示,淇河鲫MSTN c DNA序列全长2094 bp(no.KC851952.1),包含86 bp 5′非编码区、880 bp 3′非编码区和1128 bp开放阅读框,编码375个氨基酸残基,前22个氨基酸残基为信号肽,34~256位氨基酸残基为TGF-β前肽域,281~375是TGF-β结构域,具蛋白酶水解位点RIRR和C端生物活性区的9个保守半胱氨酸残基。蛋白同源分析发现淇河鲫MSTN与鲤形目鱼类相似性较高,与哺乳动物和鸟类的相似性最低。系统进化分析显示,淇河鲫MSTN与鲫、鲤、鳡等鲤科鱼类亲缘关系较近。实时定量PCR分析表明,淇河鲫MSTN基因在各个组织中均有表达,脑中表达量最高,其次为肌肉和肝脏,肠道表达量最低。淇河鲫胚胎发育的各阶段MSTN基因均有表达,受精卵表达量最高,其次为囊胚期,神经胚期表达量最低。推测MSTN与淇河鲫肌肉发育生长具有一定的相关性,可能参与"双背鲫"特征的形成。     

鳡肌肉生长抑制素(MSTN)基因的克隆及其组织特异性表达分析

以鳡肌肉总RNA为模板,采用RTPCR和RACE的方法,获得了鳡肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的3个重叠片段,测序后拼接得到2 177 bp全长cDNA序列,其包含了5′端非翻译区的89个核苷酸和3′端非翻译区1 052个核苷酸以及1 125个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸,其中前22个氨基酸为鳡MSTN的信号肽。鳡MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和在C端生物活性区含9个保守的半胱氨酸残基。核苷酸和氨基酸同源性分析发现鳡MSTN与厚颌鲂、草鱼和鲤等鲤形目鱼类的同源性较高,与鲈形目的同源性较低,与哺乳动物和鸟类的同源性最低;系统发育分析表明鳡MSTN与厚颌鲂亲缘关系最近。 半定量RT-PCR分析表明,该基因在肌肉和脑中表达量最高,在心肌中也有较高表达,在肝脏、肠、鳃和肾等组织中未见明显表达,此结果表明鳡MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,可能还有其他功能。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变。存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709。统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05)。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变.存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709.统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05).     

牙鲆mstn基因SNPs位点多态性与生长性状的关联分析

为研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉生长抑制基因(mstn)多态性,开发其分子辅助育种新标记,采用重测序方法对120尾牙鲆(3个双克隆杂交家系：60尾;3个雌核发育家系：60尾)的mstn基因进行单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)位点筛选,并对不同基因型个体的生长性状进行多重比较及SNP标记验证。结果显示,共检测到7个SNPs位点,均为颠换型突变;外显子区3个(Exonl 1:G2063A; Exonl 3:C3883T, C4009A),为同义突变;内含子区3个(Intron 1:A2444T; Intron 2:T3816C, A3832C);3’端非编码区1个(3’UTR:C4564A)。SNPs与生长性状关联分析结果表明,A3832C和C4564A标记位点与牙鲆体质量、体长、体高等生长性状显著相关(P<0.05),其中A3832C位点AA基因型和C4564A位点AC基因型在生长上表现出优势,A3832C位点CC和C4564A位点AA、CC基因型在生长上表现出劣势,其他5个SNPs位点对牙鲆生长...     

加州鲈肌肉生长抑制素(MSTN)cDNA的克隆和序列分析

肌肉生长抑制素是抑制肌肉生长和发育的生长调控因子。对运用RT-PCR和RACE技术从加州鲈成鱼肌肉总RNA中扩增得到的MSTN cDNA全序列进行了序列分析。结果表明,加州鲈MSTN cDNA全长为1626bp,其开放阅读框为1 134bp,共编码377个氨基酸,前面的22个氨基酸为信号肽,中间有四个氨基酸(RARR)为蛋白水解加工位点;该基因总共有13个半胱氨酸残基,后面9个在蛋白水解加工位点之后的C端生物活性区,与其它脊椎动物比较,它们的位置完全一致,对该基因的结构和功能非常重要。与GenBank中已知的条纹狼鲈、金鲷、斑马鱼、虹鳟、斑点叉尾鮰、人、猪、鸡、鸽MSTN的ORF相比较,核苷酸序列同源性为63%~94.4%,氨基酸同源性为61.4%~96%,特别是在C端生物活性区氨基酸同源性为88.1%~100%,高度的保守性反映了该基因受到了高度的进化限制以及功能的重要性。加州鲈MSTN基因的克隆为研究该基因打靶和鱼类肌肉发育调控机理奠定了基础。     

ENU诱变草鱼家系生长特性及肌肉生长抑制素基因SNP筛选的研究

经过175 d养殖,对4个N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变草鱼家系进行生长对比,采用显著性比较,偏相关分析和因子分析统计方法对草鱼体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析,进而运用双向测序法对MSTN1、MSTN2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示,家系4的生长速度明显大于家系3,家系4的8个性状明显大于其他3个家系;家系1中体长、尾柄长、体厚与体质量密切相关,家系2中体长、头长、体厚与体质量密切相关,家系3中全长、体长、尾柄高与体质量密切相关,家系4中全长、体长、体厚与体质量密切相关。由此可知,家系4和家系3具有明显的生长差异。对于MSTN1基因,家系3在465位点C/G、467位点G/A,家系4在465位点C/G均发生错义突变;对于MSTN2基因,家系3和4在912位点C/T均发生同义突变,家系3在1027位点G/A、家系4在366位点A/G均产生错义突变,位于非编码区1390位点A/T和1401位点G/A在两个家系均发现SNP位点。试验结果表明,MSTN1、MSTN2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼的生长性状存在紧密联系。     

牙鲆efhd2和tbc1d25基因的克隆和表达分析

为在分子水平解析牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗淋巴囊肿病的机理,本研究克隆牙鲆淋巴囊肿抗病免疫相关基因efhd2和tbc1d25的c DNA全序列,运用生物信息学方法对基因序列进行了详细分析;同时,采用荧光定量PCR分析了efhd2和tbc1d25基因在牙鲆胚胎发育不同阶段、淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织的表达特征。结果显示,efhd2基因c DNA全长为5231 bp,开放阅读框(ORF)长为699 bp,编码232个氨基酸。tbc1d25基因c DNA全长为3173 bp,ORF长为2601 bp,编码866个氨基酸。定量结果显示,efhd2和tbc1d25基因在胚胎发育的各个时期均有不同程度的表达,其中,efhd2在出膜仔鱼期表达量最高,而tbc1d25在受精卵中的表达量显著高于其他时期(P0.05)。在所研究的淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织中,efhd2和tbc1d25基因均有不同程度的表达,抗病个体的血液中,这2个基因的表达量均显著高于患病个体(P0.05)。本研究结果为深入探讨efhd2和tbc1d25基因功能和解析牙鲆淋巴囊肿抗病机理提供了基础资料。     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。     

牙鲆中 Dicer 基因的鉴定与表达

通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中克隆了牙鲆Dicer基因序列,该序列全长6 585bp,包括5 691 bp的开放阅读框,编码1 896个氨基酸。在多个物种间的蛋白序列对比中,牙鲆Dicer与其它物种的同源性平均高达78%,与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)同源性最高达到89%;在进化树分析中,牙鲆Dicer与其它鱼类Dicer聚集一支。荧光定量PCR显示,牙鲆Dicer基因在牙鲆大脑里的表达最高。同样的,在牙鲆胚胎和仔鱼早期发育阶段里也发现了相对高水平的Dicer mRNA表达。在用甲状腺激素(TH)处理过程中发现,牙鲆Dicer基因在用TH处理后17 dph的表达最高。本研究预测了牙鲆Dicer在牙鲆发育和变态过程中扮演的重要角色,为进一步阐明Dicer在牙鲆变态发育中的功能奠定了基础。     

牙鲆dazl基因的克隆与表达分析

dazl(deleted in azoospermia-like)基因是多种物种精子发生的重要调控因子,为探讨该基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺发育分化中的作用,本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了牙鲆dazl基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析了其序列结构,并利用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现:牙鲆dazl cDNA序列全长2 031 bp,包括105 bp的5'端非翻译区,1 275 bp的3'端非翻译区和编码217个氨基酸残基的651 bp开放阅读框;氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的RRM(RNA recognition motif)结构域,且该结构域在鱼类中具有100%的序列一致性;荧光定量PCR结果显示dazl基因主要在牙鲆性腺中表达,且在精巢中的表达高于卵巢;在牙鲆早期发育阶段,dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有较高的转录本,而在原肠胚期表达开始降低,至孵化后3 d一直保持较低的水平,这些丰富表达的母源性dazl mRNA可能参与了胚胎发育中原始生殖细胞的形成。本研究为进一步阐明dazl基因在牙鲆生殖发育中的功能奠定了基础。     

牙鲆蛋白质感染因子蛋白基因的克隆和结构分析

采用RT-PCR方法分离牙鲆（Paralichthys olivaceus）蛋白质感染因子蛋白编码基因序列。推测的牙鲆蛋白质感染因子蛋白由472个氨基酸组成，分子量约49．6kD，具有信号肽、短肽顺接重复、疏水区、糖基化位点、二硫键、糖基缩醛磷肌醇锚定位点等蛋白质感染因子蛋白特征结构域，与红鳍东方纯（Fugu Rubripes）和大西洋鲑（Atlantic salmon）蛋白质感染因子蛋白的相似性分别为71．9％和66．4％。牙鲆蛋白质感染因子蛋白编码基因序列的获得为蛋白质感染因子进化与功能研究以及可能存在的鱼类传染性海绵样脑病研究奠定了基础。     

牙鲆let-7基因的克隆与表达及其靶基因预测

let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用.为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因.利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,...     

牙鲆SRF基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-SRF构建成功,为进一步研究SRF在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。     

牙鲆半乳糖凝集素6基因的克隆、表达及功能研究

半乳糖凝集素6 (Galectin-6)是β-半乳糖苷结合凝集素家族的成员之一。本研究首次分离并鉴定了牙鲆(Paralichthys olivaceus) Galectin-6 (PoGalectin-6),分析了其分子特征和表达模式,并对其免疫相关功能进行了研究。PoGalectin-6基因的开放阅读框长为1089 bp,共编码362个氨基酸,其中包含2个糖识别结构域(CRDs)。同源序列比对和系统进化树分析显示,PoGalectin-6与大菱鲆(Scophthalmus maximus) Galectin-4的相似性为80.9%。组织分布结果显示,PoGalectin-6基因主要在肠组织中特异性表达。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,PoGalectin-6基因在肠组织中的表达显著升高,感染后12 h表达量最高,随后逐渐降低并恢复至正常水平。细菌结合实验证实,PoGalectin-6重组蛋白(rPoGalectin-6)能够结合枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌(Vibrio vulnificus),但并不结合短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。此外,rPoGalectin-6以钙离子依赖的方式对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌表现出明显的凝集作用。研究表明,PoGalectin-6基因参与了由迟缓爱德华氏菌感染引起的免疫应答,这一发现为探索Galectin-6在硬骨鱼类中的免疫功能奠定了基础。