噬菌体展示技术及其在抗原表位筛选中的应用

噬菌体展示技术(Phage display technology)是以噬菌体或噬菌粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,此技术现已被广泛应用于生命科学的许多领域。本文主要介绍了噬菌体展示技术的原理,并就噬菌体表面展示系统的不同类别的表达载体分别做了描述,同时阐述了该展示技术在抗原表位研究中的应用。     

噬菌体肽库及其在抗原表位识别中的应用

肽库（peptide library)是近年来发展起来的一种新技术。它是某一长度（如5肽或6肽）短肽的大量集合,包含了该长度短肽的各种可能序列或其中的绝大部分。“肽库”概念提出的理论基础是Geyssen等的2个观点：（1）含有关键氨基酸残基的短肽能够模拟蛋白质上的表位;（2）多数情况下,几个关键残基与它的结合分子之间形成的非共价键构成了全部结合能的绝大部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部肽段间的相互作用来实现的。20世纪80年代初,Geyssen提出了模拟表位的概念,他认为1个抗原决定簇,即1个表位,只由几个氨基酸组成,并且可以用化学合成法合成这个表位,即模拟表位。随后,他用化学合成法合成了这个表位,即模拟表位。随后,他用化学合成法合成了一系列短肽（即肽库）,从中筛选出模拟表位,并证实其确定能够和原来的蛋白质发生竞争抑制作用。化学合成法具有以下优点：（1）可含非天然氨基酸;(2)可用于所有实验室的液相条件;（3）有的无需测序。但由于其合成成本太高,无法合成较长的多肽（大于20个氨基酸）,不能扩增和重复使用等缺点,使得另一种肽库技术倍受青睐,这就是噬菌体展示肽库。     

噬菌体展示技术与病毒抗原表位研究

噬菌体展示技术(Phage display technology)始创于1 985年,Smith首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,从而创建了该技术[2].     

噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用

本文主要介绍了噬菌体展示系统的原理，并就噬菌体表面展示系统的不同表达载体类别，分别做了描述，同时讨论该展示系统在抗原表位研究上的应用。     

抗原表位及其在血吸虫疫苗研究中的应用

血吸虫病是世界上危害最严重的寄生虫病之一，其疫苗的研究是世界血吸虫病防治的一项工作重点也是一大难题。抗原表位是疫苗设计和免疫识别的基础，本文对抗原表位在疫苗设计中的分子理论基础做了阐述．介绍了其在血吸虫疫苗设计中的应用，并提出了一些问题与展望。     

应用噬菌体肽库技术定位沙门氏菌鞭毛蛋白上属特异性共同抗原表位

用生物素标记的沙门氏菌属特异性单克隆抗体de7作为分子探针，应用亲和筛选法从噬菌体肽库中筛选该单抗所针对的表位克隆，最终进行定位。经三轮筛选后，用斑点印迹法检测，得到良好的富集效果。通过免疫筛选法从第三轮筛选物中桃取了24个阳性克隆，再以斑点印迹、竞争ELISA进一步鉴定阳性克隆，证实已获得了沙门氏菌鞭毛属特异性共同抗原的模拟表位。测得的序列为SRRSFTTE，将其与沙门氏菌鞭毛蛋白氨基酸序列相比较，同源性较小，但在不同血清型沙门氏菌鞭毛蛋白氨基酸序列的Ⅰ区高度保守序列中，发现61-65位氨基酸的RSXXT序列与所得的线性表位有相同的排列，而大肠杆菌鞭毛蛋白氨基酸在此段的序列为RAXXT，且这种序列排列的几率为1/20^5，因此推断该单抗所针对的表位在该区段上。此外，以阳性克隆免疫Balb/c小鼠，并制备高免血清进行间接荧光检测和竞争ELISA鉴定，结果表明其具有优良的免疫原性和高度的特异性，这亦为模拟表位疫苗的研究提供了新思路。     

噬菌体展示技术及其在抗血吸虫疫苗研究中的应用

噬菌体展示技术是新近发展起来的将外源肽或蛋白与特定噬菌体衣壳蛋白融合,并展示于噬菌体表面的一项新技术。示系统主要包括丝状噬菌体展示系统、入噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统及T7噬菌体展示系统等。该技术在抗血吸虫疫苗研究上的应用主要集中在模拟血吸虫抗原位点和直接作为疫苗载体方面,而在分析血吸虫保护性抗原位点、发现新的功能蛋白或抗原基因方面的应用研究还有待加强。本文就噬菌体展示拉术及其在抗血吸虫疫苗研制中的应用进行了简要概述,为抗血吸虫疫苗的研究提供。     

应用CSFV-E2基因噬菌体肽库筛选猪瘟病毒抗原表位

采用猪瘟单抗对猪瘟病毒石门株E2基因噬菌体随机肽库(SM-E2库)进行淘洗以研究猪瘟病毒E2抗原表位.运用猪瘟单克隆抗体WH303、WH211和M56对SM-E2库进行4轮生物淘洗,对阳性克隆再经噬菌体原位杂交、特异PCR测序分析,然后人工合成阳性多肽进行ELISA反应.经鉴定分析发现单抗WH303从SM-E2库中筛选得到一段CSFV特异的抗原多肽IECTAVSPTTLRTEVVKT,并且该段多肽与已知CSFV表位TAVSPTTLR极为相似;单抗WH211和M56未能筛选到包含CSFV序列的克隆.结果表明,利用靶基因噬菌体随机多肽库筛选抗原表位能够得到更接近于真实表位的抗原表位.     

流感病毒抗原表位的研究进展

流感病毒抗原表位的研究,不仅是对流感病毒致病机理和机体免疫系统反应的探究,还能很好地指导对流感的防治。作者从抗原表位的特点,流感病毒抗原表位的特点、研究进展及流感病毒抗原表位疫苗的应用几个方面进行了综述。     

Identification of antigenic epitopes of the SapA protein of Campylobacter fetus using a phage display peptide library

In this study, we immunized mice with prokaryotically expressed recombinant surface layer protein, SapA, of Campylobacter fetus, generated hybridomas secreting mouse monoclonal antibodies (mAb) targeting SapA, and purified the mAb A2D5 from mouse ascites using saturated ammonium sulfate solution. The mAb A2D5, coated onto ELISA plates, was used to screen the phage random 12-peptide library through three rounds of panning. Following panning, 15 phage clones were randomly chosen and tested for reactivity with mAb A2D5 by indirect ELISA. Single-stranded DNA from positive clones was sequenced and compared with the sequence of SapA to predict the key epitope. ELISA and/or Western blot analyses further validated that synthetic peptides and recombinant peptide mimotopes all interact with mAb A2D5. Nine of ten positive phage clones identified by screening were sequenced successfully. Seven clones shared the same sequence HYDRHNYHWWHT; one had the sequence LSKNLPLTALGN; and the final one had the sequence SGMKEPELRSYS. These three sequences shared high homology with SapA J05577 in the region GNEKDFVTKIYSIALGNTSDVDGINYW, in which the underlined amino acids may serve as key residues in the epitope. ELISA and/or Western blot analyses showed that mAb A2D5 not only interacted with the four synthetic peptide mimotopes, but also with 14 prokaryotically expressed recombinant peptide mimotopes. The mimotopes identified in this study will aid future studies into the pathological processes and immune mechanisms of the SapA protein of C. fetus.     

Identification of antigenic epitopes of the SapA protein of Campylobacter fetus using a phage display peptide library

In this study, we immunized mice with prokaryotically expressed recombinant surface layer protein, SapA, of Campylobacter fetus, generated hybridomas secreting mouse monoclonal antibodies (mAb) targeting SapA, and purified the mAb A2D5 from mouse ascites using saturated ammonium sulfate solution. The mAb A2D5, coated onto ELISA plates, was used to screen the phage random 12-peptide library through three rounds of panning. Following panning, 15 phage clones were randomly chosen and tested for reactivity with mAb A2D5 by indirect ELISA. Single-stranded DNA from positive clones was sequenced and compared with the sequence of SapA to predict the key epitope. ELISA and/or Western blot analyses further validated that synthetic peptides and recombinant peptide mimotopes all interact with mAb A2D5. Nine of ten positive phage clones identified by screening were sequenced successfully. Seven clones shared the same sequence HYDRHNYHWWHT; one had the sequence LSKNLPLTALGN; and the final one had the sequence SGMKEPELRSYS. These three sequences shared high homology with SapA J05577 in the region GNEKDFVTKIYSIALGNTSDVDGINYW, in which the underlined amino acids may serve as key residues in the epitope. ELISA and/or Western blot analyses showed that mAb A2D5 not only interacted with the four synthetic peptide mimotopes, but also with 14 prokaryotically expressed recombinant peptide mimotopes. The mimotopes identified in this study will aid future studies into the pathological processes and immune mechanisms of the SapA protein of C. fetus.     

法氏囊活性五肽BP5特异性结合肽的筛选及鉴定

为鉴定与具有免疫调节功能和抗肿瘤潜能的法氏囊活性五肽(BP5)特异性结合的多肽,本研究利用噬菌体展示技术,以BP5-BSA为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选,结合ELISA鉴定和竞争抑制试验,筛选出3个能够特异性与BP5结合的噬菌体阳性克隆.测序结果显示,其编码的12肽序列分别为:PINMQTLNCMAA(P2-12)、GCTLNPMSDLLG(P6-12)和MSSTLNGMLNSL(P7-12),其核心基序为TLNXM.通过人工合成P2-12、P6-12、P7-12多肽,并采用MTT法检测其对BP5抗肿瘤细胞增殖能力的影响,结果显示,P2-12和P7-12肽在0.2 μg/mL～20 μg/mL浓度下,P6-12肽在2μg/mL～20 μg/mL浓度下均能够抑制BP5抗小鼠WEHI-231 B淋巴瘤细胞增殖作用,其中P2-12在20 μg/mL浓度下抑制作用最为显著(p＜0.01).此外,p53荧光素酶活性检测结果显示,这3种BP5结合肽在实验浓度下均能够下调BP5促p53基因转录的活性.以上结果表明,这3种BP5特异性结合肽具有下调BP5抗肿瘤活性.本研究为进一步研究BP5抗肿瘤细胞增殖作用的机制提供了相关的实验依据.     

鸭坦布苏病毒HN1株囊膜E蛋白抑制肽的筛选及鉴定

鸭坦布苏病毒(DTMUV)是一个新发现的病毒,主要引起鸭产蛋严重下降为特征,为鉴定与DTMUV囊膜E蛋白特异性结合的多肽,本试验利用噬菌体展示技术以DTMUV HN1株E蛋白为靶标,进行随机12肽库3轮筛选,结合ELISA试验和竞争抑制试验,成功筛选了2个能够与DTMUV HN1株E蛋白特异性结合的多肽。测序结果显示,其氨基酸序列分别为:HWSTRQGSTRWN(P3-12)和THRSWQGNSWYM(P8-12)。进一步分析多肽P3-12和P8-12对DTMUV在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响,结果显示,E蛋白抑制肽P3-12和P8-12本身对鸭胚成纤维细胞的增殖无明显影响,不同质量浓度的的抑制肽P3-12和P8-12(0.02、0.2、2、20mg/L)均能显著降低DTMUV在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度和病毒拷贝数,以上结果表明,抑制肽P3-12和P8-12均能抑制DTMUV在鸭胚成纤维细胞的增殖,本试验为进一步探明DTMUV与宿主的相互作用及抗病毒制剂的开发提供了理论依据。     

利用mRNA差异显示技术克隆分析捻转血矛线虫滞育相关基因

以培养获得的捻转血矛线虫滞育期虫体及同期正常发育的虫体为研究材料,采用设计的锚定引物和随机引物,通过mRNA差异显示PCR技术对滞育期幼虫的差异表达基因进行了筛选。结果获得了74个滞育期差异表达的基因EST。生物信息学分析表明：29个差异序列与已知的捻转血矛线虫基因组序列具有同源性;14个差异序列与已知线虫的EST具有同源性。同源基因中的rps-30、T24F1.2等已被证明参与了秀丽隐杆线虫的滞育形成。差异序列的克隆为捻转血矛线虫滞育相关基因及滞育形成机制的研究奠定了基础。     

三肽囊素抗独特型ScFv噬菌体展示文库的构建

利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应（SOE）,以（Gly4Ser）3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VL ScFv,且ScFv DNA与噬菌粒载体pHENI的连接产物转化于大肠杆菌TGl,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素抗独特型抗体全套单链噬菌体抗体库,并将该抗体库展示在噬菌体表面,以利用噬菌体展示技术的强大筛选能力筛选出与三肽囊素同功能单链抗体（Bursin-ScFv）。     

Comparative functional genomic analysis of Pasteurellaceae adhesins using phage display

The Pasteurellaceae contain a number of important animal pathogens. Although related, the various members of this family cause a diversity of pathology in a wide variety of organ systems. Adhesion is an important virulence factor in bacterial infections. Surprisingly little is known about the adhesins of the Pasteurellaceae. To attempt to identify the genes coding for adhesins to some key components of the hosts extracellular matrix molecules, phage display libraries of fragmented genomic DNA from Haemophilus influenzae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Aggregatibacter actinomycetemcomitans, were prepared in the phage display vector pG8SAET. The libraries were screened against human or porcine fibronectin, serum albumin or a commercial extracellular matrix containing type IV collagen, laminin and heparin sulphate. Four genes encoding putative adhesins were identified. These genes code for: (i) a 34 kDa human serum albumin binding protein from Haemophilus influenzae; (ii) a 12.8 kDa fibronectin-binding protein from Pasteurella multocida; (iii) a 13.7 kDa fibronectin-binding protein from A. actinomycetemcomitans; (iv) a 9.5 kDa serum albumin-binding protein from A. pleuropneumoniae. None of these genes have previously been proposed to code for adhesins. The applications of phage display with whole bacterial genomes to identify genes encoding novel adhesins in this family of bacteria are discussed.