RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

RNA干扰沉默BmDHS基因对家蚕生长发育的影响研究初探

用家蚕4龄起蚕为材料,以桑抗冻蛋白基因dsRNA和ddH2O为对照,利用微量注射RNA干扰技术将家蚕脱氧羟腐胺赖氨酸合酶基因BmDHS的dsRNA注入幼虫体内,抑制家蚕BmDHS基因表达,获得BmDHS基因沉默表型.通过RT-PCR方法检测沉默家蚕体内BmnDHS基因mRNA水平平均下降了约25%,BmDHS靶基因Bm...     

直接利用PCR产物构建RNA干扰表达载体

利用RNA干扰原理可以对作物进行遗传改良.构建RNA 干扰的发夹结构一般采用在引物两端加酶切位点方法,该方法涉及酶切位点多,步骤繁琐.本试验介绍一种直接利用PCR产物进行RNAi组成型表达载体构建的方法,该载体以潮霉素为筛选标记基因,适合水稻的遗传转化.     

水稻条纹叶枯病毒RNA干扰载体的构建

利用已公布的水稻条纹叶枯病毒的序列和siRNA Target Finder软件,获得了168条siRNA片段,利用这些片段在水稻基因组中BIAST(Basic local alignment search tool),最终获得6条与水稻基因组完全不匹配的干扰序列.选择其中的2条.通过化学合成干扰序列,利用pCAMBIAl301质粒构建了RNA十扰载体pASVl301-1,pASVl301-2,并成功地转化EHAl05农杆菌,为进一步转化水稻、探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础.     

AtTPS03基因RNA干扰载体的构建及拟南芥转化

本研究以拟南芥DNA为模板,将罗勒烯合成酶AtTPS03基因的一个目的片段克隆到T-载体上.对克隆片段测序后,进行Blast比对,结果目的片段的序列与GenBank上报道的序列同源性达到100%.根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向连到干扰载体pFGC5941查尔酮内含子的两侧,经限制性酶切和PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体P-2AT03.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥.收获的种子在含草丁膦的培养基上筛选抗性苗,通过对抗性苗的PCR检测,已成功获得了12株转基因苗.这些转基因苗为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础.     

ahFAD2基因RNA干扰体的删除筛选标记载体构建及其遗传转化

将Napin启动子与含花生FAD2基因反向重复片段的RNA干扰结构连接,亚克隆至含雌激素诱导重组系统的植物表达载体pNCX相应位点中,构建完成由Napin启动子驱动的FAD2RNAi删除筛选标记表达载体pNCX-FAD2RNAi,经酶切鉴定,获得相应的启动子片段、FAD2RNAi片段及NCX-FAD2RNAi片段.利用农杆菌介导法进行遗传转化,已获得抗性丛生芽214丛.     

RNA干扰及其对昆虫抗药性相关基因的沉默研究

以不同农药为主的防治策略对棉铃虫和小菜蛾等农业害虫的控制卓有成效,但易产生害虫抗药性问题。害虫抗药性与细胞色素P450酶系、酯酶、钙粘蛋白等酶或受体的生化与分子机理相关。RNA干扰(RNA in-terference,简称RNAi)作为分子生物学领域中功能基因及基因组研究的一种强有力工具,已逐渐用于昆虫抗药性相关基因的敲除研究并鉴定其功能。本文围绕RNAi的作用机理及其对昆虫抗药性相关基因的沉默研究展开综述,旨在为农业害虫及其抗药性治理提供新思路与新途径。     

基于大豆花叶病毒衣壳蛋白基因的RNA干扰植物表达载体的构建

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一,大豆花叶病毒病可造成大豆10%~30%的产量损失,并严重影响大豆的品质。不同株系间致病力差异源于它们在碱基序列上的差异。采用传统的抗病育种技术育成的抗病品种抗谱窄,品种抗性可因病毒株系的变异而丢失。依靠RNA引发的基因沉默改善植物的抗病毒能力是基于RNA i(RNA inference)原理建立的植物抗病毒新策略,本研究对来源于武汉SMV分离物的CP基因和Nib基因进行了克隆,通过对保守区域的扩增,采用Gateway技术构建了大豆抗花叶病毒的RNA干扰载体。为防治大豆花叶病毒新技术的探索奠定基础。     

富有柿果ACC合成酶基因RNA干扰植物表达载体的构建

分析克隆的柿果ACC合成酶基因的序列,根据其与表达载体pSMAK311上的酶切位点设计2对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增柿果ACC合成酶基因片段。双酶切PCR回收产物以及表达载体,将酶切产物定向连接构建成反义表达载体;在此基础上构建该酶基因的shRNA表达载体,由此转录的mRNA因两端序列反向互补而成发夹式RNA,因此,可应用于RNA干扰研究。将所构建好的载体转化农杆菌EHA101用于后续的遗传转化研究。     

苎麻雄性不育相关基因atp6和atp9 RNA干扰载体的构建

植物线粒体基因缺陷是细胞质雄性不育的主要原因。为了获得苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNAi)表达载体,根据已报道的苎麻atp6和atp9基因序列设计引物,利用RT-PCR克隆了atp6和atp9基因的部分cDNA片段,将目的基因正反向片段连接入RNAi载体pHANNIBAL,再将其表达框连入表达载体pCAMBIA 1300。结果表明,所克隆的cDNA片段经序列比对后确认为目的基因片段,经酶切和测序验证确认完成了atp6和atp9基因RNAi载体pCAM-6SR和pCAM-9SR的构建。atp6和atp9基因RNAi载体是验证苎麻雄性不育的基础,也为苎麻遗传工程改良奠定了技术基础。     

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。     

植物介导的RNA干扰引起马铃薯晚疫病菌基因的沉默

由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是最具毁灭性的马铃薯病害。为明确植物介导的RNAi沉默致病疫霉基因的有效性,本研究采用重叠延伸PCR技术克隆同时与晚疫病菌4个ces基因均同源的融合基因C1234,构建内含子连接的C1234反向重复序列植物表达载体,采用农杆菌介导法转化晚疫病易感马铃薯品种大西洋,经PCR和Southern杂交检测,获得129个转基因株系。离体叶片接种病原菌后,有97个转基因株系发病速度明显慢于野生型,接种6 d后病斑大小和霉层厚度均明显小于对照,并且叶片感病部位没有出现失绿斑,而野生型产生了明显的失绿斑。实时定量RT-PCR分析发现,发病延缓的叶片上致病疫霉4个纤维素合酶基因的表达水平明显低于野生型。本研究表明,转基因植株中产生的以晚疫病菌ces基因为靶标的ds RNA能够沉默致病疫霉相应基因表达,延缓发病进程。     

OsGA20ox2不同长度RNAi片段对水稻株高等农艺性状的遗传效应

利用OsGA20ox2基因序列构建不同长度的RNAi片段并导入水稻,获得不同高度的矮化植株。将这些矮化植株与野生型植株回交获得B₁F₂群体,卡方检测表明B₁F₂群体矮秆植株数和高秆植株数符合3∶1比例,表现为矮秆显性的遗传规律。对矮化植株的F₅和B₁F₂群体株高、各茎节间长度和一些主要农艺性状方差分析显示, OsGA20ox2基因的RNAi能显著缩短株高和各节间长度(P<0.05),RNAi干扰片段越长,使植株株高和节间长度缩短程度越大,可使株高降低24~42 cm,矮化22%~39%。在同一长度的RNAi干扰片段下,倒一节节间长度平均缩短与倒二节节间长度平均缩短非常相近,倒三节和倒四节节间长度平均缩短非常相近,总的缩短程度是倒四节>倒三节>倒二节>倒一节。这种近基部节间长度缩短幅度和比例较大的特点,利于提高水稻的抗倒伏能力,同时上部节间缩短幅度和比例较小,有效地保持合理株高,不使生物产量明显降低,有利于水稻的稳产和高产。OsGA20ox2基因的RNAi不影响如千粒重、结实率、穗长等其他主要农艺性状或影响很小。     

RNA干涉机制的研究进展及植物学意义

RNA干涉(RNAi)是指由双链RNA(dsRNA)引起的序列特异性基因沉默,其中small RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中起关键作用。本文综述了RNAi中siRNA和microRNA分别介导的作用机制,RNAi在植物中的研究现状,主要包括转基因植物中的RNA干涉和植物病毒诱导的RNA干涉等方面的研究概况。评述了RNAi在植物学研究中的意义,主要包括功能基因的研究、转基因植物的研究及植物抗病性研究。     

PTGS/ RNAi的作用机制及其应用

论述了双链RNA对同源基因的表达进行特异性的封闭而引起的转录后的基因沉默（PTGS/ RNAi）现象, PTGS/ RNAi的作用机理，作用模型，参与这一过程的酶、基因、起始因子和作用因子，介绍了PTGS/ RNAi在基因组功能研究、基因的时空表达调控以及在作物改良等方面的应用。     

RNA干扰及其植物抗病毒应用

【研究目的】RNA干扰(RNA interference,RNAi)是分子生物学研究领域的一项新兴技术,在动植物的遗传改良、功能基因组、基因治疗等研究中广泛应用;【方法】它是指一些小的双链RNA分子介导的、序列特异的转录后基因沉默现象;【结果】本文就RNA干扰的作用机制、RNA干扰与植物病毒间的互作以及RNA干扰表达载体构建的一些研究进展进行了综述;【结论】随着RNAi研究的进一步深入,RNAi必将成为遗传育种工作者培育抗病毒植物的有力手段,促进植物抗病育种的发展。     

RNA干涉及其在植物改良上的应用

NA干涉是一种双链RNA诱导的转录后基因沉默现象,存在于多种生物体内.由于转录后基因沉默(PTGS)和双链RNA引起的基因沉默都具有系统传递的特性,因此可以在特定部位诱导RNAi,利用RNAi的系统传递性抑制其他部位该基因的表达.本文简要介绍了RNAi的机理,RNAi表达载体的构建方法以及RNAi传递性及其作物育种上的应用,以助于在植物研究中实现RNAi.     

软体动物毛蚶RNA干扰技术的应用研究

为了在软体动物中建立RNA干扰技术,以用于毛蚶基因功能研究。通过体外转录技术合成双链RNA,并将其注射毛蚶干扰目标基因的表达。肌肉注射双链RNA 48 h后取样,用RT-PCR技术检测目标基因的表达变化,以确定干扰的有效性。结果显示：各目标基因的表达均能被各自特异的双链RNA有效干扰而降低。在注射双链RNA后不同时间点,即12、48、72、96、120 h,取样检测目标基因的时序表达,以确定目标基因表达被干扰的时间效应。发现目标基因的表达在48 h即能有效降低,而且有效时间能持续至120 h以上。对注射双链RNA的动物个体,于48 h取样检测不同组织的目标基因表达,发现毛蚶的RNA干扰效应能系统性地在不同组织发生,表明干扰效应能在不同组织之间进行传递。因此,本研究报道了一种稳定的毛蚶RNA干扰技术,为在毛蚶中进行基因功能鉴定和抗病毒研究提供了一个有效的分子生物学的方法。     

RNA干涉技术及其在作物育种研究中的应用

RNA干涉(RNAi)是通过双链RNA(dsRNA)将同源mRNA高效特异降解,从而阻断特定基因的表达。作为一种新兴的下调表达技术在作物研究中得到广泛应用。本文简要概括RNAi的原理,回顾了近年来RNAi技术在作物基因功能研究、作物品质改良、作物抗病虫方面的应用,并对其存在的问题作了初步探讨。