茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯作用下的转录组分析

 本文利用Illumina HiSeq测序技术,对在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(methyl gallate,MG)作用下和对照条件下的茄青枯拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)Rs-T02菌株的转录组进行测序分析,并用GO和KEGG Pathway富集化分析的方法分析差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的功能和代谢通路,以初步了解MG对R. solanacearum作用的分子机制。结果表明,MG处理组和对照组的差异表达的基因有2 172个,其中1 037个基因上调,1 135个基因下调。随意挑选10个DEGs进行qRT-PCR验证,其基因表达趋势与转录组测序结果一致。通过对差异表达基因的功能和代谢通路分析发现,与细胞结构相关的肽聚糖水解酶、3-磷酸甘油酰基转移酶和UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸连接酶等蛋白的编码基因上调表达,蛋白YeaQ、外膜蛋白W和外膜蛋白BamE等蛋白的编码基因下调表达;与能量代谢相关的ATP合成酶结构蛋白、辅酶Q亚基和细胞色素等蛋白的编码基因上调表达,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、甘油醛脱氢酶和异柠檬酸裂解酶等蛋白的编码基因下调表达;与致病性相关的gspD、gspE和gspF等基因上调表达,hrpY、hrpB和gspG等基因下调表达;与细菌抗药性相关的氨基酸的氨酰-tRNA连接酶、核糖体RNA小亚单位甲基转移酶G基因和多重药物外排泵亚基AcrA等蛋白的编码基因上调表达;与细菌运动性相关的flgB、flgC和flgD等基因上调表达。推测MG对Rs-T02菌株的抑菌机制可能与MG影响病菌的细胞结构和能量代谢相关基因的差异表达有关;同时,MG影响病菌T3SS和T2SS相关基因的差异表达,从而影响细菌的致病力。此外,3-磷酸甘油酰基转移酶基因、核糖体RNA小亚单位甲基转移酶G和多重药物外排泵亚基AcrA基因等上调表达,可能与病菌抵抗MG的机制有关。     

红掌青枯病的症状和病原菌鉴定

 描述海南儋州某红掌栽培基地红掌发生青枯病的症状,根据对该病原菌的形态、染色反应、培养性状、生理生化特性的测定结果,将病原菌鉴定为茄青枯拉尔氏菌[Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.]。通过对病原菌的寄主范围测定,病原菌属茄青枯拉尔氏菌小种1,根据对6种糖、醇利用的测定结果,病原菌属于生物变种3。     

红掌和金边凤梨茎基腐病菌鉴定

多年生常绿草本花卉红掌Anthurium andraeanum[1]和凤梨具有很高的观赏和经济价值,是近年来流行的室内盆栽植物[2]。红掌的主要致病菌有寄生疫霉Phytophthora parasitica、棘腐霉Pythiumpringsheim、茄病镰刀菌Fusarium solani、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、茄青枯拉尔氏菌R     

噻唑蓝法和刃天青法检测植物成分对两种病原细菌的抑菌活性

通过比较茄青枯拉尔氏菌和柑橘黄单胞菌柑橘致病变种菌量、噻唑蓝和刃天青的浓度、抑菌剂与菌体作用时间等因素对吸光值的影响,优化噻唑蓝和刃天青法检测抑菌剂抑菌活性的条件,即:细菌初始浓度为10⁵~10⁶ CFU/mL,噻唑蓝和刃天青浓度分别为0.5 mg/mL和0.02 mg/mL,抑菌剂作用时间16~24 h。运用优化的噻唑蓝和刃天青法检测了植物提取物和分离物对2种细菌的抑菌活性,2种方法得到的结果一致。以茄青枯拉尔氏菌为靶标菌,对于无色化合物EE-1和土黄色化合物EE-2,2种方法测定的最低抑菌浓度相同,分别为10 μg/mL和20 μg/mL。表明噻唑蓝和刃天青法能快速、准确地测定微量植物成分的抑菌活性。     

青枯雷尔氏菌温度相关致病基因yqhE功能研究

不同温度下青枯雷尔氏菌表达谱PPI网络分析发现,yqhE可能是青枯雷尔氏菌新的温度相关致病基因。克隆青枯雷尔氏菌CBM613的yqh E基因,结果发现该基因长度为831 bp,共编码276个氨基酸。基因敲除结果显示,28℃培养的yqhE突变株较野生型菌株致病力降低,病程延长,但并未彻底丧失致病力。20℃和28℃培养的yqh E突变株维生素C的生物合成皆被抑制;与28℃相比,20℃培养下野生型菌株维生素C的合成能力降低。突变株在20℃和28℃培养下甲基乙二醛（MG）和丙二醛（MDA）明显积累,其中20℃积累更多;20℃培养的野生型菌株MG和MDA比28℃积累更多。维生素C的生物合成被抑制导致青枯雷尔氏菌自由基清除能力减弱与氧化应激反应增强,MG和MDA积累产生细胞毒性,上述结果可能与28℃培养的突变株致病力减弱,20℃培养的野生型菌株致病力丧失有关。综上结果表明yqhE是青枯雷尔氏菌温度相关致病基因。     

青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹多态性分析

 采用SDS-PAGE技术对70株不同来源及致病力青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行胞外蛋白指纹多态性分析,研究结果表明,供试青枯雷尔氏菌菌株呈现丰富的胞外蛋白指纹多态性,多态性比率为100%。不同来源青枯雷尔氏菌分泌的胞外蛋白不同,EZ-Tn5TM插入诱变菌株电泳出20条不同大小蛋白条带,分子量集中在20~97 kD ,且菌株间蛋白条带相似或完全相同;60Co辐射诱变菌株共电泳出16条不同大小的蛋白条带,多数蛋白分子量44.3 kD;野生型菌株电泳的蛋白条带最多,共获得26条不同大小的蛋白条带。进一步对37株不同致病力的野生型菌株进行胞外蛋白含量测定,结果表明,不同致病力菌株胞外蛋白含量差异大,强致病力菌株分泌的胞外蛋白含量较高,为1.026～5.963μg/mL,无致病力菌株胞外蛋白含量较低,为0.083～0.761 μg/mL。     

青枯菌GMI1000效应蛋白RipQ对致病力的作用研究

青枯菌通过Ⅲ型分泌系统向寄主植物细胞分泌100多种效应蛋白,对寄主植物的抗感病性产生影响。青枯菌效应蛋白RipQ启动子区存在典型的HrpB识别序列PIP box (5′-TTCGG-N15-TTCGC-3′),但其功能尚未明确。本研究分析了RipQ在青枯菌4种演化型菌株中的分布情况。以青枯菌GMI1000为出发菌,构建ripQ缺失突变体和过表达菌株,研究效应蛋白RipQ在青枯菌-番茄植物互作中的功能。结果显示,ripQ广泛分布于除演化型IV的不同青枯菌类群中。与野生型菌株相比,ripQ突变体在番茄上的致病力有一定程度的增强,而ripQ过表达菌株的致病力显著降低。突变体和过表达菌株在培养基中的生长与野生型没有区别,但过表达菌株在番茄体内的繁殖能力下降。RipQ过表达菌株侵染番茄后hrpB、hrpG和epsA基因表达量显著下调,且能够诱导番茄叶片H₂O₂的大量累积,过敏性坏死反应标志基因hin1和水杨酸信号通路标志基因PR1a的诱导表达。另外,在番茄上瞬时表达ripQ也可以观察到H₂O₂积累及叶片细胞坏...     

Acp菌株对桉树青枯拉尔氏菌的溶菌作用

从桉树细菌青枯病发病植株的根围土壤中分离出的一株芽孢秆菌(Bacillus sp.)Acp菌株,与青枯拉尔氏菌(Ralstonia salanacearum)PAq菌株在适宜于两菌株生长的马铃薯蔗糖液体培养基中共培养。通过检测两菌株群体数量的消长和菌体形态结构的变化等发现,Acp菌株与PAq菌株在接种菌数比例为1∶2×106的条件下,48h后,后者可被前者全部溶解致死;前者则可进行正常的生长繁殖,并完成其生长循环。透射电镜观察发现,PAq菌株细胞在与Acp菌株的相互作用中,其细胞壁皲裂、溶蚀,并有细胞内容物泄出。在含有PAq菌株的双层无菌蒸馏水琼脂和双层马铃薯蔗糖琼脂平板上Acp菌株均可形成清晰的菌落噬斑。研究证明,Acp菌株在共培养系统中通过溶菌作用使青枯拉尔氏菌种群消亡,并利用其溶菌产物作为唯一营养源而生长。     

青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统hrcN基因的功能分析

hrcN是植物病原菌Ⅲ型分泌系统基因（T3SS）的结构基因之一,对病原菌的致病力有重要影响。本研究克隆青枯雷尔氏菌CBM613的hrcN基因并作生物信息学分析,结果显示该基因长度为1320 bp,共编码439个氨基酸,预测HrcN蛋白无信号肽,无跨膜区域,整体呈弱亲水性,该蛋白为ATP酶,定位于细胞内膜和细胞质。基因敲除结果显示,菌株CBM613的hrcN突变体与野生型菌株在富营养培养基上的生长速率差异不明显,而在贫营养培养基上前者的生长速率显著快于后者。敲除hrcN基因后,青枯雷尔氏菌的运动能力无明显变化,生物被膜形成能力显著降低。以敲除突变型和野生型青枯雷尔氏菌株接种番茄,与后者相比,前者的致病力下降,病情指数降低,病程延长,但并未完全丧失致病力,表明hrcN基因是青枯雷尔氏菌致病性相关的重要基因。本研究为进一步探索青枯雷尔氏菌致病机制及防治具有重要意义。     

不同寄主植物青枯菌菌株的比较研究

 根据番茄、茄、马铃薯、花生、甘薯、姜、桑、油橄榄、木麻黄九种植物上22个青枯菌的菌株,进行形态、染色、生理生化反应、致病性等方面的比较研究的结果,证明它们都是属于青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum Smith)。因此,以前报道的甘薯瘟的病原细菌Pseudomonas batatas Tseng and Fan,应改为Pseudomonas solanacearum Sncith,不同寄主青枯菌菌株,它们的有些生理生化反应有明显的差异,但更为明显的是它们的致病性不同。测定的7种寄主上的青枯菌菌株,根据它们对茄的致病力很强,番茄、茄、姜、花生、甘薯、油橄榄和木麻黄菌株可归入小种1;马铃薯菌株对马铃薯的致病力很强,而对茄、番茄和辣椒的致病力中等,归入小种3。属于小种1的7种植物的菌株,致病性也有所不同,它们可作为不同的菌系。桑菌株的致病性较为特殊,很难归入已报道的小种。根据对6种糖和醇的利用以及脱氮作用的能力,番茄、茄、花生、油橄榄菌株属生物型Ⅱ;姜、木麻黄、甘薯菌株属生物型Ⅳ;马铃薯菌株属生物型Ⅱ,桑菌株属生物型Ⅰ。但桑菌株人工接种不侵染茄和马铃薯。烟叶过敏反应的测定表现黄斑而从未表现过敏反应,它的归属尚待进一步研究。青枯假单胞菌划分为小种和生物型,目前意见还不一致,加上我们测定的菌株有限,有关这方面的工作,也待进一步研究。     

基于iTRAQ定量蛋白质组技术筛选‘华月’苹果斑点落叶病抗性相关蛋白

 为了探讨苹果叶片抗病相关蛋白的表达特性,进一步解析苹果叶片自身防御反应分子机制,本文以抗病苹果品种‘华月’为试材,采用iTRAQ定量蛋白质组技术分析苹果链格孢菌处理前后,苹果叶片总蛋白差异表达情况。结果表明,与无菌水处理的叶片相比,病原菌接种后的叶片共筛选到433个差异表达蛋白,聚类分析结果较好,其中257个蛋白显著上调,176个蛋白显著下调。进一步开展差异蛋白筛选及功能分析,筛选后的53个蛋白依据功能可划分为7类,分别为代谢过程相关,防御或逆境应答反应相关,蛋白质代谢过程相关,细胞分裂相关,细胞壁修饰相关,细胞过程相关及其他功能未知蛋白。代谢通路分析表明,KEGG共富集到7个结果,64个蛋白在7条通路中得到注释,且这些蛋白对这7条信号通路均具有显著影响(P<0.05)。亚细胞定位分析结果表明,共49个蛋白得到成功定位,其中35个蛋白定位于叶绿体,表明叶片细胞中大量的叶绿体蛋白参与了病原菌胁迫应答反应。其他蛋白中,7个定位于细胞质,3个定位于细胞质膜,其余4个分别定位于细胞壁、胞外、过氧化物酶体及内质网。除了防御或逆境反应相关蛋白,光合作用及其他代谢相关蛋白也参与了苹果叶片细胞的防御反应。病程相关的PR类蛋白中包括3个过氧化物酶类蛋白(PR-9)、1个类甜蛋白(PR-5)及1个MLP样蛋白(PR-10),过敏反应相关的MLP样蛋白在果树应答逆境胁迫的研究中的报道较少,MLP蛋白的差异表达可能也与苹果叶片的防御反应相关。本研究进一步证实了苹果叶片应答链格孢菌胁迫的抗性相关蛋白中,PR类蛋白的差异表达可能是影响苹果叶片细胞抗病反应的关键因子,研究结果为进一步解析果树抗病分子机制提供了参考。     

苹果叶片应答斑点落叶病菌胁迫的蛋白质组学分析

In order to elucidate key proteins related to disease-resistance in apple leaves,the total proteins were extracted from control and infected apple leaves, and separated by two-dimensional electrophoresis. The differential expressed proteins were then identified by MALDI-TOF-TOF/MS.In total, 25 differential expressed proteins were detected by Image Master Software. After tryptic digestion, MALDI-TOF-TOF/MS analysis and database searching, 20 protein spots were finally identified, including 11 functional proteins related to photosynthesis, energy metabolism, stress and defense responses. The pathogenesis-related proteins involved in defense responses such as APX, GPX and Mal d1 were differentially expressed in apple leaves. It indicates that these proteins may play a key role in the resistance to A. alternata apple pathotype.     

外源茉莉酸甲酯诱导的水稻叶片蛋白质差异表达分析

 以抗稻瘟病水稻近等基因系C101LAC及CO39为材料,应用差异蛋白组学技术对外源茉莉酸甲酯（MeJA）诱导8 h和12 h后的水稻叶片蛋白质差异表达变化进行了分析。采用PEG 4000预沉淀法提取水稻叶片总蛋白,经双向电泳、凝胶染色和图像分析,结果表明：与对照相比MeJA处理后的2个水稻品系中共有21个蛋白质表现为2倍以上的表达差异。其中,MeJA处理8 h后,CO39中的差异表达蛋白质点有5个,C101LAC中有8个,U5为2个品系中均新增的蛋白质点。MeJA处理12 h后,CO39中有6个差异表达蛋白质点,C101LAC中则有5个。经胶内酶解、MALDI TOF/TOF质谱分析及数据库检索,成功对21个差异表达蛋白质进行了鉴定,其中新增的蛋白质点U5被鉴定为内切β 1,3 1,4 葡聚糖酶。依据GO数据库和UniProtKB数据库提供的蛋白质注释信息,按照功能可将21个差异表达蛋白质分为8类,分别在植物抗性、氨基酸代谢、信号转导、光合作用、光呼吸、糖代谢、蛋白质合成与分解及细胞代谢等方面发挥作用。     

牧草优势寄生性天敌伞裙追寄蝇滞育相关蛋白分析

为探究牧草优势寄生性天敌伞裙追寄蝇Exorista civilis滞育的分子调控机制，利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白组学技术对滞育和非滞育伞裙追寄蝇蛋白进行定量检测及功能注释，筛选差异蛋白，并对其进行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析。结果显示，滞育和非滞育伞裙追寄蝇共鉴定到1 055个蛋白；伞裙追寄蝇滞育后95个蛋白差异表达，其中24个差异蛋白表现为下调，71个差异蛋白表现为上调。KEGG通路富集分析显示滞育伞裙追寄蝇的差异蛋白在脂质、氨基酸及碳水化合物代谢等代谢通路显著富集。GO功能分析结果发现与代谢相关的蛋白显著表达，与昆虫抗寒性相关的热休克蛋白也表现为显著上调。表明物质代谢在伞裙追寄蝇滞育过程中起重要作用。     

苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学分析

 蛋白质提取方法是双向电泳分析的关键。本研究中,我们通过优化提取条件,建立了适于苹果枝条表皮总蛋白提取的技术体系。在此基础上,开展了苹果枝条表皮应答轮纹病菌侵染的蛋白质组学研究,以期明确轮纹病菌胁迫下苹果枝条表皮细胞参与抗病反应的关键蛋白。具体方法是以未接菌及接菌后的苹果枝条表皮为材料,分别提取总蛋白,利用双向凝胶电泳技术结合质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)检测分析差异表达蛋白。经质谱检测及数据库检索,共有22个蛋白点得到成功鉴定,按照功能划分为光合作用相关、糖类及能量代谢相关、防御反应相关、蛋白质合成相关及未知功能蛋白等5类。其中参与防御反应的病程相关蛋白(APX、 β-1,3-葡聚糖酶、Mal d1、PR-1)可能是苹果枝条表皮细胞应答轮纹病菌胁迫过程中参与抗病反应的关键蛋白。     

受烯丙异噻唑诱导的水稻叶片蛋白质表达差异分析

采用烯丙异噻唑对空育131水稻进行灌根处理,利用双向电泳技术分析诱导后的水稻叶片和对照叶片蛋白质的表达差异,通过PDQuest8.0.1软件分析比较诱导组和对照组的双向电泳图谱后找到10个差异表达(2倍以上)上调的蛋白质点,取其中表达量较大的8个进行质谱分析。结果显示,这8个蛋白分别具有泛醌-细胞色素C还原酶活性、苏氨酸肽链内切酶活性、苹果酸脱氢酶活性、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、磷酸核酮糖羧化酶活性、交替氧化酶活性、抗坏血酸过氧化物酶活性和质体特异性30S核糖体蛋白质活性。其中P1、P3和P4蛋白参与植物的呼吸代谢途径;P2蛋白参与蛋白质降解途径;P5蛋白参与植物糖的合成;P6和P7蛋白参与活性氧代谢平衡。研究表明,烯丙异噻唑是通过增强水稻呼吸作用、激活蛋白质降解、促进抗病相关糖的合成和提高活性氧清除能力等从而提高水稻的抗病性。     

小麦种质N9820抗白粉病的特异基因表达谱分析

小麦白粉病是由白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的世界性真菌病害之一,白粉病原菌的生理小种多,毒性变异速度快,很容易造成品种抗病性的丧失。培育抗病新品种有两种基本措施,一是发现与利用新的抗病基因;二是诱导防御     

寄主诱导下的玉米弯孢叶斑病菌致病性分化相关蛋白的动态变化研究

 Reinoculation and two-dimensional electrophoresis were performed to analyze the pathogenicity differentiation of Curvularia lunata.Resistant host inbred lines Shen135,Mo17,and 78599-1 were reinoculated(six generations) with low virulent isolate WS18.Results showed that the disease index had no significant change for the first 2 generations of inoculation.At the third generation,the incidence of disease was increased and the number of differential expressed proteins of mycelia were more than that in the first 2 generations.More than 100 differential expressed proteins were found in the mycelia of fifth generation when compared with the original one.In the experiment,10 differentially expressed proteins were identified by MALDI-TOF-MS analysis.Three proteins were related directly to the differentiation of virulence,2 were related to allergen,4 were related to the metabolism of carbon or signaling pathway and 1 was unkonwn to Curvularia lunata.