铃铛子发根诱导体系及培养条件的优化

铃铛子(Anisodus luridus)是西藏特有的托品烷生物碱药源植物.利用农杆菌C58C1(pRiA4)侵染铃铛子不同器官考察发根诱导频率,并考察了7种培养基(1/2MS,MS,1/2B5,White,WPM,B5和N6)对发根生物量和托品烷生物碱质量分数的影响.真叶和茎段的发根诱导频率分别为53.33%和60.00%,子叶不能诱导出发根.PCR表明rolB和rolC基因已整合到发根的基因组中.B5培养基最适于铃铛子发根生物量和托品烷生物碱积累,发根鲜质量和干质量分别达到6.9±0.94g/瓶和0.44±0.06g/瓶;发根中莨菪碱质量分数为3.49±0.13mg/g.B5和1/2B5培养基中发根的东莨菪碱质量分数高于其他的培养基,分别为1.37±0.06mg/g和1.43±0.22mg/g,二者之间差异无统计学意义.在B5培养基中发根总生物碱产量也是最高的,为2.1±0.29mg/瓶.研究结果为利用发根规模化生产莨菪碱和东莨菪碱奠定了基础.     

PMT 和H6H 双基因共转化提高三分三托品烷类生物碱质量分数

三分三是我国特有的托品烷类生物碱药源植物.采用基于发根的外源基因表达技术,农杆菌介导遗传转化 三分三,获得转烟草PMT 和莨菪H6H 基因的发根、基因组PCR鉴定转基因发根、液体摇床培养后,HPLC检测 发根中莨菪碱和东莨菪碱质量分数.结果发现:在三分三转基因发根中,能够同时检测到1177bp的莨菪H6H 基 因片段和451bp的烟草PMT 基因片段,而非转基因发根没有检测到这2个基因,表明外源PMT 和H6H 这2个 基因整合进了三分三基因组.转基因发根系T11中东莨菪碱质量分数最高,比非转基因发根系高出近6倍,比自然 根高出近25倍;转基因发根系T25中莨菪碱质量分数最高,比非转基因发根系高出近8倍,比自然根高出近75 倍;转基因T25中东莨菪碱和莨菪碱总量最高,比非转基因发根系高出近7倍,比自然根高出近44倍.     

人参发根的诱导及其分子检测

[目的]探讨发根农杆菌诱导人参发根分子机理。[方法]用发根农杆菌A4菌株感染3年生人参根外植体,在无激素的MS培养基上诱导人参发根,并对其进行分子检测,考察rolB和rolC基因是否转化并整合到人参基因组中。[结果]成功获得了人参发根,该发根在固体和液体培养基上得到了很好的继代;从人参发根DNA中检测到rolB和rolC基因,与已发表发根农杆菌质粒相应的核苷酸序列的同源性达到99%。[结论]发根农杆菌质粒的rolB和rolC基因已转化并整合到人参基因组中,是人参发根产生的分子机理。     

3 种常用培养基对颠茄毛状根生长与次生代谢产物积累的影响

研究了B5,MS,N6 3种培养基对颠茄毛状根的生长及托品烷类生物碱质量分数和产量的影响.结果表明:B5,MS培养基中颠茄毛状根的生物量明显高于N6培养基,两者之间差异无统计学意义,但B5培养基中东莨菪碱和莨菪碱质量分数与产量均显著高于MS培养基.因此,比较3种培养基,B5培养基作为基本培养基不仅有利于颠茄毛状根的生长,也对托品烷类生物碱的合成有促进作用,为建立适合其生长和次生代谢产物产生的离体培养体系提供了理论依据.     

发根农杆菌A4菌株诱导三分三毛状根的研究

利用发根农杆菌A4菌株侵染三分三组培苗叶片诱导毛状根,并对其毛状根进行继代增殖培养;采用PCR技术检测毛状根。结果表明：发根农杆菌A4菌株Ri质粒的rolB基因已整合到三分三叶肉细胞的基因组中,进而成功地从叶片诱导出毛状根,诱导率可达77%以上;毛状根除菌后,能在无激素的MS固体培养基上快速生长。三分三遗传转化体系的建立为实现基于毛状根的三分三产托品烷类生物碱的代谢工程奠定基础。     

外源性5氨基乙酰丙酸对盐胁迫下颠茄生理特性及次生代谢产物含量的影响

通过对颠茄幼苗生理特性及生物碱含量的研究,寻找提高颠茄在盐胁迫条件下的抗性能力以及提高生物碱含量的途径.采用100 mmol/L NaCl溶液和不同质量浓度5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)溶液处理颠茄幼苗,对颠茄叶片的叶绿素含量、叶绿素荧光参数、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶(SOD,POD)活性及莨菪碱、东莨菪碱含量进行测定.结果表明:叶面喷施5-ALA可显著(p0.05)提高抗氧化酶活性及叶绿素含量、渗透调剂物质含量,降低盐胁迫对细胞质膜过氧化程度和PSⅡ的损伤程度,同时可提高盐胁迫下颠茄中东莨菪碱的产量,但是对莨菪碱产量的作用不明显.外源5-ALA可有效缓解盐胁迫对颠茄生长的抑制,提高其抗盐能力.     

我国中草药代谢基因研究获重大突破

我国生物技术专家唐克轩教授主持的课题组，运用转基因手段，在国际上首次将甲基转移酶和羟化酶同时转入药用植物莨菪中，筛选获得高质量的莨菪药用组织细胞（俗称毛状根）。研究结果表明，东莨菪含量与原来的细胞组织相比，药用成分提高了9倍。这是我国中草药植物代谢基因研究在该领域内获得的重大突破，在国际上首次大幅度提高了药用植物中东莨菪碱的含量。     

外源铁蛋白基因NtFerl对粳稻生理影响的研究

[目的]验证铁蛋白基因的功能,提高转基因粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。[方法]利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因mnrl导入粳稻基因组。[结果]对T0、T1代卡那霉素抗性植株PCR、Southern杂交、Northern杂交和RT—PCR检测分析表明,外源基因已整合到粳稻基因组中,并能够稳定遗传表达。转基因粳稻超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和叶绿素相对含量高于对照,丙二醛（MDA）含量低于对照,其根、叶片和糙米中铁含量均高于对照。接种稻瘟病病菌后转基因植株叶瘟指数低于对照。[结论]转入外源铁蛋白基因NtFerl能够提高粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。     

颠茄PMT·TR-I和H6H基因植物高效表达载体的构建

[目的]构建1,4-丁二胺-氮-甲基转移酶（Putrescine N-methyltransferase,PMT）基因、托品酮还原酶-I（Tropinone reductase-I,TR-I）基因和莨菪碱6-β-羟化酶（Hyoscyamine 6β-Hydroxylase,H6H）基因的植物高效表达载体。[方法]采用RT-PCR方法从颠茄中克隆到PMT、TR-I和H6H基因编码区序列,并连接到植物表达载体pCAMBIA1304^＋（p1304^＋）中。[结果]成功构建了植物高效表达载体p1304^＋-PMT、p1304^＋-TR-I、p1304^＋-H6H、p1304^＋-PMT-H6H、p1304^＋-TR-I-PMT和p1304^＋-TR-I-H6H,并转化农杆菌,获得可直接用于遗传改良颠茄的工程菌。[结论]该研究为利用植物基因工程技术提高东莨菪碱的产量奠定了基础。     

发根农杆菌介导芸芥的遗传转化及其次生代谢物的研究

[目的]研究发根农杆菌介导芸芥的遗传转化条件,并测定次生代谢物的含量。[方法]通过发根农杆菌R1000介导的遗传转化,建立芸芥发状根的诱导和培养体系,采用氯化钯分光光度法和高效液相色谱法对该发根培养物合成硫苷的能力进行初步分析,并分析乙酰丁香酮（As）、浸染液pH值和浸染时间等因素对发状根转化频率的影响。[结果]子叶的转化率明显高于下胚轴;AS最佳浓度为100mg／L,浸染液最佳pH值为5．4,最佳浸染时间为20min。PCR的鉴定结果表明,发根农杆菌R1000的rolB基因已成功地转入并整合到该发根培养物的基因组中。[结论]该方法建立了芸芥发状根培养体系,并初步分析了该发状根中硫苷的含量,为以后的研究奠定了一定的基础。     

外源铁蛋白基因NtFer1对粳稻生理影响的研究

[目的]验证铁蛋白基因的功能,提高转基因粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。[方法]利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因NtFer1导入粳稻基因组。[结果]对T0、T1代卡那霉素抗性植株PCR、Southern杂交、Northern杂交和RT-PCR检测分析表明,外源基因已整合到粳稻基因组中,并能够稳定遗传表达。转基因粳稻超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和叶绿素相对含量高于对照,丙二醛(MDA)含量低于对照,其根、叶片和糙米中铁含量均高于对照。接种稻瘟病病菌后转基因植株叶瘟指数低于对照。[结论]转入外源铁蛋白基因NtFer1能够提高粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。     

马铃薯与曼陀罗交互嫁接后药用生物碱的积累特征

【目的】探明托品烷类生物碱（Tropane alkaloids，TAs）在茄科植物中的转运和积累特征，并探索利用马铃薯块茎高生物量特性来富集TAs的可能性，为进一步拓宽TAs的研究方法和制取方法提供参考。【方法】以曼陀罗和马铃薯品系滇薯1418（D1418）为材料，进行交互嫁接，使用HPLC分别测定砧木和接穗各组织器官中的TAs含量。【结果】利用HPLC技术通过等度洗脱能有效分离和测定试验植物样本中的莨菪碱、阿托品、（-）山莨菪碱、（+）山莨菪碱和东莨菪碱。曼陀罗/D1418嫁接的曼陀罗接穗果实中TAs含量最高，为121.77 μg/g，接穗各组织器官主要富集（±）山莨菪碱，含量为29.15～87.98 μg/g；D1418/曼陀罗嫁接的马铃薯接穗茎、叶均能有效转运和积累TAs，其中莨菪碱含量最高，分别为76.02 μg/g和110.64 μg/g。【结论】马铃薯地下部块茎和叶腋处气生薯中均检测到5种托品烷类生物碱，马铃薯块茎能够积累一定量的TAs；曼陀罗和马铃薯茎叶中转运和积累TAs的机制可能存在差异；利用HPLC技术通过等度洗脱能有效分离和测定以曼陀罗和马铃薯交互嫁接植物样本中各组织器官的TAS含量。     

颠茄H6H基因的克隆及高效植物表达载体的构建

[目的]克隆颠茄（Atropa belladonna）H6H基因并构建高效植物表达载体。[方法]采用RT—PCR方法从颠茄中克隆莨菪碱-6β羟化酶和1,4丁二胺-氮-甲基转移酶基因编码区,插入经改造后获得双元三价植物高效表达载体P2301-gus,构建植物表达载体p2301-H6H,并将该表达栽体导入根癌农杆菌LBA4404和发根农杆菌C58C1。[结果]获得了可直接用于遗传改良的颠茄工程茵p2301-H6H-LBA4404和p2301-H6H-C58C1。[结论]为利用植物基因工程技术提高颠茄中生物碱含量奠定了基础。     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。     

共转化获得无抗性标记的转反义蜡质基因籼稻

【目的】利用转基因技术将反义蜡质基因导入籼稻成熟胚愈伤组织中,改良籼稻稻米直链淀粉含量。【方法】用根癌农杆菌介导的方法将p13W8质粒（含反义蜡质基因）和pCAMBIA1300质粒（含抗潮霉素抗性基因）对2个籼稻品种的成熟胚愈伤组织进行遗传共转化。【结果】供试材料愈伤组织继代培养18～24 d后具有较高的转化频率和分化频率,可作为共转化的良好受体;抗性愈伤组织PCR检测结果表明,抗潮霉素抗性基因的阳性检测率为97.6%,反义蜡质基因的阳性检测率为27.1%。在46株转基因潮霉素抗性植株中,反义蜡质基因阳性株为5株,占转基因植株的10.9%。经PCR检测,发现上述4个株系T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因片段的分离,从286个T1单株中筛选到了39个单株只带反义蜡质基因片段,而无潮霉素抗性基因的转基因植株,占T1单株总数的13.6%。部分转反义蜡质基因植株种子的直链淀粉含量有不同程度的降低。【结论】通过农杆菌介导的遗传共转化方法,将反义蜡质基因Waxy导入籼稻成熟胚愈伤组织,获得了直链淀粉含量明显降低的仅含反义蜡质基因籼稻株系。     

农杆菌介导的双SBE基因RNAi载体对水稻的遗传转化

[目的]提高水稻中直链淀粉的含量,扩大稻米的利用范围。[方法]以水稻中花11品种为材料,通过农杆菌介导法,侵染水稻幼胚诱导出的愈伤组织,将淀粉分支酶基因SBE1和SBE3同时导入受体愈伤组织,经过一系列的共培养、预分化、分化、生根壮苗后,获得含有转基因的转化植株,并对转化植株进行PCR鉴定。[结果]通过用根癌农杆菌介导法,侵染由水稻幼胚诱导的274粒愈伤组织,经过共培养、筛选,得到177粒抗性愈伤,然后将抗性愈伤预分化、分化得到103株分化苗,生根壮苗后获得49株转基因植株;从49株转基因植株中随机提取34株的基因组DNA,利用PCR技术从基因组DNA中扩增得到了片段大小约为500 bp的潮霉素基因序列。[结论]初步证实转基因植株的真实性,淀粉分支酶基因SBE1+SBE3成功整合进入水稻基因组中。     

根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究

通过根癌农杆菌介导法将反义fad2-1基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度、预培养时间、共培养时间、恢复培养时间、乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株。PCR、PCR-Southern blotting检测结果表明,反义fad2-1基因成功转入并整合于大豆基因组。GC检测结果表明,转反义fad2-1基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而亚油酸含量降低了20.27%。     

反义CCoAOMT基因转化烟草调控木质素生物合成

通过农杆菌介导法将美洲黑杨CCoAOMT cDNA反向导入烟草,获得一批转基因抗性植株.经PCR检测,证明CCoAOMT基因已成功反义转入到烟草植株中.通过对转基因植株和对照植株木质素含量的对比分析,大部分转基因株系木质素含量均有不同程度下降,下降最多的达9.2%.     

茉莉酸甲酯对颠茄毛状根的生理指标及托品烷类生物碱积累的影响

该文研究茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ)对颠茄毛状根的逆境生理指标及莨菪碱、东莨菪碱含量的影响.结果表明,MJ的加入对颠茄毛状根生长具有一定的抑制作用,MDA、脯氨酸、可溶性蛋白质含量均有不同程度的变化:增加或先增加后降低;3种保护酶(SOD,POD,CAT)活性变化与诱导浓度有关;30μmol/L的MJ处理组东莨菪碱含量最高,10μmol/L的MJ处理组莨菪碱含量最高.表明MJ能显著促进颠茄毛状根中生物碱成分的积累.     

转反义GhADF1基因对陆地棉纤维品质的影响

 【目的】将反义的棉花GhADF1基因导入陆地棉基因组,进一步了解抑制GhADF1基因对棉花纤维品质的影响。【方法】构建了GhADF1基因的反义植物表达载体,通过农杆菌介导法转化陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种Coker312。【结果】通过PCR检测卡那霉素抗性选择和系统选育获得3个不同转基因事件纯合系（A5、A9、A20）,Southern blot显示：反义GhADF1基因已整合到受体基因组中,且能稳定遗传。转基因纯合系连续3代纤维品质分析显示,它们的纤维比强度和长度与对照相比都显著提高。【结论】转反义GhADF1基因可以提高棉花纤维比强度和长度,改善棉纤维品质。