甘蔗花叶病毒辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。     

甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及系列表达载体的构建

采用RT-PCR法,从表现玉米矮花叶病症状的玉米叶片中克隆了外壳蛋白(Coat protein)基因。测序和同源性比较结果表明:所克隆的CP基因来自甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)MDB株系,编码219个氨基酸。以CP基因为目的基因,构建了用于基因枪转化的p35SCPfBar,p35SCPrBar,pUbiCPfBar,pU-biCPrBar 4个表达载体和用于农杆菌转化的pCAMBIACPf,pCMABIACPr 2个表达载体。     

甘蔗花叶病毒四川分离物的鉴定和遗传变异分析

玉米和甘蔗是西南地区两种重要的禾本科农作物,而病毒病的常年发生严重威胁着玉米和甘蔗的生产.从四川攀枝花田间采集表现花叶、褪绿、斑驳或矮化等病毒病症状的玉米样品54份和甘蔗样品42份,用小RNA深度测序结合反转录聚合酶链式反应进行病毒检测,以明确引起该地区玉米和甘蔗病毒病的病原.结果显示：从玉米病株上检测到甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)、玉米黄花叶病毒(maize yellow mosaic virus, MaYMV)和留尼旺玉米线条病毒(maize streak Reunion virus, MSRV), 3种病毒的检出率分别为66.7%, 59.3%和3.7%;从甘蔗病样中检测到SCMV(52.4%)、甘蔗瓜德罗普杆状病毒A(sugarcane bacilliform Guadeloupe A virus, SCBGAV)(76.2%)和高粱花叶病毒(sorghum mosaic virus, SrMV)(28.6%).鉴于SCMV在玉米和甘蔗田间样品中的高检出率,利用其外壳蛋白基因对SCMV四川分离物的遗传变异进行综合分析.系统发育分析表明...     

甘蔗花叶病毒复制酶基因的克隆及序列分析

以甘蔗花叶病毒(SCMV)福建分离物(FJ)的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增了含有复制酶(NIb)基因的DNA片段,将其克隆到质粒pGM-T载体上并进行了序列分析。结果表明,NIb基因由1563个碱基组成,编码521个氨基酸并含有高度保守序列GDD。NIa/NIb和NIb/CP交界处的蛋白酶切割位点分别为Q/C和Q/A。与国外报道的SCMV亚组几个株系分离物相比,NIb基因(福建分离物)的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为57.8%~86.9%和60.9%~95.2%,其中与SCMV-SA株系的核苷酸及氨基酸序列同源性则高达86.9%和95.2%。     

白草花叶病毒基因RNAi表达载体的构建

对PenMV-B的HC基因与PenMV-C的HC基因进行同源性分析,确定HC基因的保守片段.根据保守序列设计引物,以PenMV HC-Pro基因的cDNA为模板, PCR扩增能形成"发夹结构"的正反向片段,连接后插入到质粒载体pCAMBIA3301.通过冻融法将载体直接导入农杆菌中,用于农杆菌介导的玉米转化.     

地黄花叶病毒河南分离物检测鉴定及其MP序列分析

2019年夏,在河南温县中草药园内发现种植的地黄呈现疑似病毒侵染所表现出的褪绿、花叶等症状,采集该样品,用Trizol法提取地黄样品总RNA,分离其siRNA,并进行文库构建和siRNA高通量测序。将测序结果经接头去除、拼接组装后(Velvet Software 0.7.31,k=17),与NCBI数据库中序列进行核酸比对分析,发现该样品中存在着地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus, ReMV)和瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)的部分片段。通过RT-PCR确认该样品存在ReMV的侵染,使用商业化的ELISA试剂盒进一步确认该样品被ReMV侵染过。进一步克隆ReMV河南分离物的MP序列,并结合NCBI数据库中发布的该病毒MP序列,构建了基于MP序列的ReMV河南分离物系统发育树。该研究丰富了ReMV群体的传播范围及其基因组遗传信息,为后续ReMV的深入研究奠定了基础。     

甘蔗花叶病毒南城分离物外壳蛋白基因序列测定及分析

从江西南城甘蔗病株中获得1个甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)分离物,命名为SCMV-NCH。根据SCMV外壳蛋白(CP)基因N-端和C-端保守序列设计引物,对SCMV-NCH的CP基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,获得924个核苷酸(nt),推断编码308个氨基酸(aa)的近全长CP基因序列。与SCMV亚组SCMV、高粱花叶病毒(SrMV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、约翰逊草花叶病毒(JGMV)、玉米花叶病毒(ZeMV)、白草花叶病毒(PenMV)等6种病毒代表性株系外壳蛋白氨基酸序列同源性比较结果显示,SCMV-NCH与SCMV的同源性最高(86.2%),与其他5种病毒同源性相对较低(56.4%~72.2%)。与SCMV13个分离物外壳蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建关系树,结果显示SCMV-NCH与我国浙江2个分离物(Yuhang和Xiaosh)具有最近的亲缘发生关系。     

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因hpRNAi表达载体的构建

为了构建建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)复制酶RdRp基因hpRNAi的表达载体,根据GenBank中CymMV和ORSV RdRp基因的保守序列设计引物,以蝴蝶兰温室生产中两种病毒的分离物为模板,成功扩增了两种病毒的RdRp基因片段。扩增的这两种病毒的RdRp基因与数据库中病毒序列同源性均在98%以上。利用融合PCR将两种病毒片段串联在一起,然后通过Gateway技术的BP反应和LR反应将融合产物插入到基因沉默表达载体pHellsgate12中,成功构建了可同时抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的发夹结构RNA干扰载体,为兰花多抗基因工程育种奠定了基础。     

地黄花叶病毒河南分离物的CP基因克隆及序列分析

为探究地黄花叶病毒(rehmannia mosaic virus, ReMV)在河南地黄上的发生与分布及其基因变异情况,从河南温县中草药园采集若干疑似受病毒侵染而呈现出花叶、枯萎等症状的地黄样品,用酚仿法提取地黄样品总RNA,通过PCR扩增目的基因地黄花叶病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因片段,经过回收纯化后,克隆至pMD19-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,随机挑选4个阳性单克隆测序,最后将结果与NCBI数据库中已有的核苷酸序列进行比对,并结合NCBI数据库中已发布的不同地区ReMV分离物的CP基因序列,构建基于CP^ReMV核苷酸序列的ReMV不同地区分离物的系统进化树。结果表明：成功克隆出ReMV河南分离物的CP基因,将该序列上传至NCBI后获得GenBank登录号为OM964874;通过构建系统发育进化树,该分离物与郑州、山西、韩国报道的ReMV分离物亲缘关系较近,可能有相近传染源,而与美国、日本的分离物亲缘关系较远,存在一定的遗传分化,序列一致性分析结果与此一致。综上,这一研究扩大了ReMV群体的传播范围,丰富了其基因信息,为揭示ReMV的...     

甘蔗花叶病毒诱导玉米TPT基因cDNA克隆及功能分析

玉米矮花叶病(MDM)是影响世界玉米生产的重要病害之一,利用转病毒源基因如外壳蛋白(CP)基因等多种植物基因工程技术防治玉米矮花叶病,取得了一定的效果,但存在着防效不高等问题。现拟从植物源获得与抗甘蔗花叶病毒相关的基因,并通过转基因方法获得抗甘蔗花叶病毒自交系。以国内广泛应用的抗甘蔗花叶病毒玉米自交系黄早四为材料,利用cDNA-AFLP差异显示方法,获得了203个差异片段。经反向Northern验证和同源性分析,差异片段中的A9T6与玉米磷酸丙糖转移蛋白(TPT)基因高度同源。为明确TPT在抗病毒病中的作用,根据报道的玉米磷酸丙糖转移…     

玉米矮花叶病病原河北株系的分子鉴定和外壳蛋白基因的序列分析

从河北省石家庄地区田间表现典型的矮花叶症的玉米病叶中得到分离物MD-HB,按照报道的马铃薯Y病毒属CP基因前后保守区序列的比较,设计合成了一对引物,采用RT-PCR法扩增了1 2kb的全长外壳蛋白(CP)和病毒基因组的3′末端非编码区(3′-URT)的cDNA序列,将其克隆到pGEM-T载体上,并进行序列分析。结果表明,CP基因由939个碱基组成,编码313个氨基酸并含有与蚜虫密切相关的DAG(Asp-Ala-Gly)序列。Nib/CP基因交界处的蛋白酶切位点为Q/S。与侵染禾本科作物的马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组的4种病毒代表株系甘蔗花叶病毒(SCMV-Ger)、SCMV-MDB、玉米矮花叶病毒(MDMV-A)、高粱花叶病毒(SrMV-H)和约翰逊草花叶病毒(JGMV-O)对应的序列进行比较,结果核苷酸序列的同源性依次为94 4%、84 3%、67 5%、74 2%和60 1%,氨基酸序列的同源性依次为95 5%、87 9%、67 1%、70 3%和58 8%;另一方面,此病毒分离物与来自甘蔗的SCMV株系SCMV-A和MDMV-SC的核酸序列及氨基酸序列的同源性分别为82%、81 1%和83 1%、82 8%,说明它们具有较远的亲源关系。认为应将我国SCMV玉米分离物单独从SCMV划分出来,作为SCMV亚组的一个新病毒种而不是SCMV的一个株系。     

SrMV和SCMV侵染玉米的细胞超微病变比较研究

运用超薄切片电镜技术比较观察了高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗花叶病毒(SCMV)侵染玉米叶片细胞的超微结构变化,结果显示:线状SrMV和SCMV粒子分散或成束分布在感病细胞的细胞质内,同时在细胞质中产生大量柱状内含体.SrMV引起风轮体和卷筒体,属于Edwardson等划分的第Ⅰ型,一些内含体分布于细胞壁附近,有的直接与细胞壁胞间连丝相接.SCMV引起风轮体、卷筒体和片层聚集体,属于第Ⅲ型,一些成束的病毒粒子和内含体存在于筛管中.对两种病毒的细胞病理学效应作了比较,并对可能与病毒胞间运动相关的超微结构进行了讨论.     

甘蔗花叶病毒(SCMV)种群结构分析

针对已公布的18个甘蔗花叶病毒(SCMV)全基因组序列,利用MEGA 5.1分析了其11个蛋白(P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、Nib、CP-C和多聚蛋白)编码基因所受的选择压,并结合其编码蛋白的功能,预测了部分基因在SCMV进化过程中的角色和变异位点.结果显示:P1和CP-N端的变异性程度较大,P1蛋白多样性最高;CP-C端变异性和多样性均较低;PIPO受到的选择压最小,但多样性最低,可能是由于PIPO与P3共用一段编码序列.来源于甘蔗的SCMV多聚蛋白的第2 853、2 897和2 904个氨基酸位点(在CP中部)分别为T、R和E,而来源于玉米的SCMV多聚蛋白对应的氨基酸位点分别为S、K和D,表明这3个位点具有寄主依赖性.     

果蔗脱毒对光合作用及产量的效应

分析了茎尖培养获得的花叶病脱毒果蔗拔地拉叶片叶绿素含量、净光合速率 (Pn)及一些叶绿素荧光参数的变化 .结果表明 ,脱毒果蔗的叶绿素含量、Pn、光合系统 原初光能转换率和潜在光化学反应活性均比感染花叶病的果蔗高 ,而且脱毒果蔗生长快 ,后期不早衰 ,蔗茎产量比未脱毒的高 30 %左右 ,品质获得显著改善     

芜菁花叶病毒杭州分离株外壳蛋白基因序列分析

从杭州郊区分离出一个ＴｕＭＶ强毒株系，利用分子克隆和Ｓａｎｇｅｒ双脱氢测序方法分析了其外壳蛋白基因的ＤＮＡ序列．该序列与已报道的其他４种ＴｕＭＶ分离物都具有较高的同源性，最高达９７．６％，最低达８９．５％，其氨基酸序列的同源性更高，最高达９７．９％，最低达９４．５％。本文分析了该序列中ＡＴ和ＧＣ含量，计算了４种核苷酸在有意义链中和在密码子不同位置上的出现频率，同时还分析了该病毒外壳蛋白氨基酸遗传密码的使用频率。     

缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及植物表达载体构建

以CMV亚组1株系Fny-CMV RNA2基因组为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到2.5 kb的全长复制酶基因扩增产物.对此产物进行纯化,并用NcoI和BspHI进行双酶切,得到3个片段,将不含有GDD保守区的2个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的扩增产物.将其克隆到pGEM-T Easy Vector上,进行序列测定,结果表明GDD保守区确已缺失.该缺失不导致开放阅读框架的移码将缺失GID保守区的基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,并经三亲交配导入根癌农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

侵染中国甘蔗和玉米的SCMV CP基因序列多样性分析

【目的】揭示侵染中国甘蔗及玉米的甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）的遗传多样性，为抗病品种培育及病害综合防治提供依据。【方法】以病株叶组织总RNA抽提物为模板，通过RT-PCR扩增及扩增产物直接测序获得了华南地区SCMV 26个甘蔗及玉米田间分离物的近全长CP基因序列，结合GenBank中已公布的部分相应序列，采用序列比对及分子系统进化树重建方法，对SCMV CP基因序列的变异性进行分析。【结果】中国SCMV可分为3个分子组群，各组群分别对应于各自来源的寄主，即杂种甘蔗(糖用甘蔗, Saccharum interspecific hybrids)、玉米(Zea mays)和高贵甘蔗（果用甘蔗,Saccharum officinarum）。CP基因核苷酸同一性，不同组群之间为78%～84%，同一组群内部各分离物之间大于91%。在分子系统进化树中，这3个分子组群各自聚集成簇，前两个组群分别隶属于Alegria等（2003）建立的甘蔗组（sugarcane group，SCE 组）和玉米组（maize group，MZ组），第3个组群为本研究首次发现，命名为高贵甘蔗组（noble sugarcane group，NSCE组）。侵染杂种甘蔗的SEC组不存在明显的地域分化，而侵染玉米和高贵甘蔗的MZ组和NSEC组则可对应地理来源分为若干亚组，前者可分为华东华中亚组、西北西南亚组及华南亚组，后者至少包括华南亚组和浙江亚组。在玉米、杂种甘蔗及高贵甘蔗混栽区，不同作物上的SCMV可以通过蚜虫传播而交叉侵染，但各组群间依寄主种类存在相对隔离现象。本研究还发现中国华南地区，SCMV可自然侵染甘蔗近缘属杂草河八王（Narenga sp.）和芒（Miscanthus sp.）。【结论】在中国，SCMV存在丰富的遗传多样性，其分化与寄主类型密切相关，可分为杂种甘蔗组、玉米组和高贵甘蔗组，其中玉米组和高贵甘蔗组又可根据地理来源分为若干亚组。在抗病品种的选育及病害综合防治中，必须充分考虑到病毒的这种分化现象。     

利用斑点杂交法和RT-PCR技术检测甘蔗花叶病毒

利用地高辛标记不同长度的 DNA探针通过斑点杂交法对甘蔗花叶病毒进行检测 .结果表明 ,可检测出2 0 0 mg稀释度为 1/10 4 病叶中的病毒 .但不同长度的探针表现出一定的差异 ,较长的探针显示出较高的灵敏度 .根据克隆所得的病毒基因序列设计特异引物 ,利用反转录 -聚合酶链式反应的方法进行检测 ,同样得到较好的检测效果 ,但灵敏度略低于杂交检测 .     

北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花叶病毒CP基因序列分析及亚组鉴定

从宁夏和北京地区甜椒上分离到3个黄瓜花叶病毒分离物(宁夏分离物为CMV-NX1,NX2;北京分离物为CMV-BJ)并保存在普通烟上。从叶片中提取该病毒RNA,经RT-PCR扩增到780bp的全长CP基因的cDNA,PCR产物纯化并测序。2个宁夏分离物(NX1,NX2)核甘酸序列同源性为100%,它们为同一株系。与已报道的部分CMV株系的CP基因序列相比较,表明3个分离物与CMV亚组I同源关系比亚组II更密切,因而3个分离物都属于黄瓜花叶病毒亚组I,通过DAS-ELISA进一步验证它们都属于亚组I。