花生AhGPAT9与AhLPAAT4基因的原核表达及Western Blot分析

酰基转移酶基因家族是甘油三酯合成的关键基因。本研究以前期克隆的AhGPAT9与AhLPAAT4基因部分序列设计引物,构建原核表达载体,转化进大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测表明,重组蛋白在37℃,5h诱导条件下获得高效表达。重组蛋白经纯化和富集,对新西兰兔进行4次免疫,纯化获得的多克隆抗血清,通过间接ELISA检测,表明获得了效价比较高的多克隆抗体。通过对重组蛋白纯化后样品进行Western Blot分析,结果显示在纯化样品相应位置有明显信号,表明所制备的抗体具有很高灵敏度和特异性。并采用制备的抗体对AhGPAT9与AhLPAAT4蛋白在花生不同组织及种子不同发育时期的表达进行了Western Blot分析。为深入研究AhGPAT9与AhLPAAT4基因的功能提供了科学数据。     

水稻黑条矮缩病病毒外壳蛋白基因S10的原核表达、多克隆抗体制备及应用

用RT-PCR方法从感染水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)水稻中克隆该病毒的外壳蛋白基因S10,然后将此外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体PET-32a中构建成重组原核表达载体pET32a-CP。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+ NTA亲和柱纯化获得分子量约为76kD含硫氧还蛋白的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子制备RBSDV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了可靠、灵敏、特异的检测RBSDV的免疫捕获RT-PCR及Dot-blot ELISA方法,为该水稻病毒病的诊断提供技术支持。     

玉米质体型淀粉磷酸化酶抗体的制备

通过同源基因基因克隆、原核表达载体构建、GST融合蛋白诱导表达与纯化、新西兰大白兔免疫、抗血清分离和纯化制备了SPI多克隆抗体,并进行了玉米体内蛋白Western blot验证。结果表明,成功构建的PGEX-6T-1-SPI-C表达载体在大肠杆菌中表达并纯化了GST-SPI-C融合蛋白,通过免疫新西兰大白兔制备并纯化了SPI多克隆抗体。制备的SPI多克隆抗体不但能识别GST-SPI-C融合蛋白,而且能识别玉米体内全长SPI蛋白(112 kD),并具有较好的特异性。玉米子粒和胚乳的Western blot检测表明,SPI蛋白主要积累在胚乳中,与mRNA定量结果一致。     

油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S:: BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol.L-1的IPTG诱导8h后,pCzn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55 mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

茶树α-tubulin基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

根据茶树α-微管蛋白(α-tubulin)的mRNA全长序列(GenBank登录号DQ340766)设计引物,以RT-PCR方法扩增茶树α-tubulin基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,并转化至大肠杆菌BL21trxB(DE3)中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式表达。以纯化后的α-tubulin融合蛋白制备兔多克隆抗体,用Westernblot方法检测抗体特异性。结果显示α-tubulin蛋白以包涵体形式大量表达,以融合蛋白制备的抗体对茶树体内的α-tubulin具有良好的特异性。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5′非翻译区(5′ Untranslated region,5′-UTR)、226bp的3′非翻译区(3′ Untranslated region,3′-UTR)和2 079bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码75.1kD的蛋白质。5′-UTR中含有12bp的uORF (Upstream open reading frame),编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a(+)-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E. coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

原核表达番木瓜环斑病毒NIa-Pro及其双重酶活鉴定

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)编码的核内涵体蛋白a蛋白酶(Nuclear inclusion body a proteinase,NIa-Pro)是一种多功能病毒非结构蛋白,在病毒侵染宿主及病毒与宿主互作中起着重要作用。本研究利用以麦芽糖结合蛋白(MBP)为融合表达框架的原核表达系统构建了表达NIa-Pro的重组载体pMAL-c5xNP,并转化大肠杆菌,经IPTG诱导和Ni~(2+)-NTA-琼脂糖亲和层析纯化获得了可溶的重组融合蛋白MBP-NIa(N端和C端分别融合MBP和His标签),然后利用蛋白酶Factor Xa切去重组融合蛋白中的MBP,再通过直链淀粉树脂亲和层析纯化获得了可溶的重组蛋白NIa-Pro。活性检测结果表明,重组蛋白PRSV-NIa-Pro具有非特异的双链DNA酶和特异的蛋白酶双重活性。     

甘蓝型油菜类甜蛋白激酶BnTLK1与真菌病害抗性相关

类甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）是病程相关蛋白第5家族蛋白，在部分物种中发现有的TLP蛋白C端融合了激酶结构域。为探讨该类融合基因在植物与病原菌互作中的作用，通过生物信息学方法在甘蓝型油菜中鉴定到一个N端具有TLP结构域，C端为富含丝氨酸苏氨酸受体类激酶结构域的基因（BnTLK1）并成功克隆该基因。序列分析表明BnTLK1第254至276个氨基酸具有典型的跨膜结构，三级结构形成两个明显独立的TLP和激酶结构域。转录组数据显示，该基因在多个组织中表达丰度较低，此外，相比于菌核病感病品种Westar，高抗品种ZY821中其表达丰度较高，且核盘菌诱导后表达明显上调，表明该基因可能参与油菜抗菌核病过程。为了验证BnTLK1对核盘菌等真菌的影响，通过原核表达系统成功表达BnTLK1蛋白，在0.4 mmol/L IPTG和17℃低温条件下诱导培养，最终获得BnTLK1可溶性蛋白，抑菌实验发现BnTLK1能够抑制核盘菌和灰霉菌丝的生长。     

花生AhFT基因的克隆与序列分析

FT(Flowering Locus T)作为"成花素"在成花转变及促进开花上起重要作用。本研究利用分子克隆和RT-PCR方法,从花生中克隆了一个与FT同源的cDNA序列,命名为AhFT,该序列长度为893bp,开放阅读框长度为534bp,推测编码蛋白含有177个氨基酸,分子量为19.95kD,等电点为6.9。通过与其他植物PEBP蛋白序列的比对,发现花生FT基因属于FT-Like家族,可能在控制植物开花中起重要作用。     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框(包括终止密码子),编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高(GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159),并在DE3中高效表达。     

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。     

水稻小热休克蛋白OsHSP20抗体特性鉴定及应用

【目的】在前期克隆了一个水稻小热休克蛋白(OsHSP20)的基础上,进一步分析该蛋白多克隆抗体的免疫反应特性和应用范围,为深入鉴定该类基因的功能奠定基础。【方法】利用合成多肽和其原核表达产物分别免疫家兔制备了相应的多克隆抗体;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA用于分析比较多克隆抗体效价和灵敏度;Western blot用于鉴定多克隆抗体的特异性和应用范围。【结果】Western blot分析显示,利用重组OsHSP20蛋白及其合成多肽所制备的多克隆抗体均可以在原核表达OsSHSP样品中特异性检测到1条大小与预期一致(37kD)的条带,表明两种方法获得的多克隆抗体都具有高度的特异性;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA分析表明,利用重组蛋白制备的多克隆抗体效价和灵敏度均高于利用多肽制备的抗体。进一步的Westernblot分析显示该抗体可用于多种植物小热休克蛋白(SHSP)的检测。【结论】制备了OsHSP20蛋白质抗体,且具有高度的特异性和较高的效价和灵敏度,可广泛地用于多种单、双子叶植物HSP20蛋白的表达分析,有助于OsHSP20及其他植物同源蛋白的功能鉴定。     

香蕉束顶病毒海口分离物NSP基因的原核表达

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆NSP (Nuclear shuttle protein)基因的编码区,并通过Gateway技术定向重组到原核表达载体pDEST~(TM)-17中的6xHis标签下游,经菌落PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了原核表达载体pDEST~(TM)-17-NSP.阳性克隆转化Ecoli BL21(DE3),经IFFG诱导表达、SDS-PAGE分析和western blot检测,结果显示,融合蛋白以包涵体的形式稳定表达,分子量约为20 ku,与预计值相符.通过诱导条件的优化,确定了最佳的融合蛋白表达条件为25℃、0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4h.从而为制备NSP多克隆抗体和进一步研究NSP的功能奠定了基础.     

褐飞虱两个dynamin-1-like基因的克隆、多克隆抗体制备及表达定位

【目的】研究dynamin-1-like的两个基因NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的生物学功能。【方法】通过聚合酶链式反应扩增褐飞虱dynamin-1-like的两个基因,并对其生物信息学进行分析。通过荧光定量PCR技术(qPCR)检测了这两个基因在褐飞虱不同组织和不同发育阶段中的相对表达量。构建原核表达载体,在表达菌株Rosetta中诱导重组目的蛋白的表达。通过Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,并将纯化得到的蛋白免疫新西兰大白兔,得到多克隆抗体,并用ELISA检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。利用上述抗体,通过免疫荧光实验观察目的蛋白在褐飞虱卵巢中的表达和定位。【结果】克隆并鉴定了两个dynamin-1-like基因,分别命名为NlDNM1L-1和NlDNM1L-2(Gen Bank登录号分别为KY082900、KY082901)。系统进化树表明,NlDNM1L-1和NlD NM1L-2在半翅目昆虫中较为保守。蛋白结构预测和基因时空表达分析说明,NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中可能有着不同的功能。ELISA和Western blotting结果表明,制备的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2多克隆抗体效价高、特异性好。免疫荧光实验结果显示,NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢滤泡细胞中普遍表达,可能与褐飞虱卵巢发育和成熟有关,它们也可能与类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。【结论】获得了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2基因序列,了解了其基本的生物信息,并阐明了其时空表达特征;成功制备其多克隆抗体,并初步了解了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢中的表达和定位。这些结果为深入研究NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的功能奠定了基础。     

香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。