棉花黄萎病菌毒素ELISA检测方法的建立及其应用

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌毒素的A蛋白双抗体夹心ELISA方法。应用建立的ELISA方法测定了病菌培养滤液、人工接种幼苗和大田病株不同组织中的毒素,结果表明:不同产毒能力菌株(VD 8和VD-5)在25℃下振荡培养3d后就能在培养滤液中检测到毒素,这比生物测定要早2～3d。将VD-8菌株的孢子以灌根方式接种泗棉3号幼苗5d后,就能从接种幼苗的茎杆和叶柄中检测到毒素,这比幼苗自然发病显症要早3～5d。在测定的30份大田病株茎杆、叶柄、叶脉样品中,阳性样品率为100%。这些结果表明建立的ELISA方法可用于菌株产毒能力的测定和大田棉花黄萎病的早期诊断。     

棉花黄萎菌落叶型菌系毒素纯化及抗血清制备

用SephacrylS 200HR层析柱纯化了V991菌系毒素,经叶片针刺涂抹方法确认其致萎功能后,免疫大白兔制备了抗血清。用间接ELISA方法对强、中、弱3种不同致病力共10个菌株的培养液进行了特异性检测,结果表明:抗血清具备一定生理型特异性,能够准确检出全部强致病力落叶型菌系,可作为不同生理型划分的指标之一。用毛细管电泳、SDS PAGE和Western杂交方法检测了V991毒素的组分:在中性条件下,毒素在毛细管电泳时存在2个峰;SDS PAGE将毒素分为8条带,其中4条主带具有强烈的致萎性;Western点杂交的反应强度与相应蛋白回收带的致萎功能之间明显相关。     

间接ELISA法检测棉子携带黄萎病菌新方法

以棉花黄萎病菌Bp2培养液中毒素蛋白免疫BALB/C小白鼠制备抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌的间接ELISA方法。所制备的毒蛋白抗血清效价为1∶204800,对毒蛋白的最低检测量达7.81μg.L-1。可以与江苏省各地采集到的棉花黄萎病菌的培养液发生特异性反应,而与其它致病菌培养液反应呈阴性。用该方法对81份江苏省抽样的棉子进行检测,12份呈阳性反应。取检测为阳性反应的这些棉子培养液针刺接种棉苗也全都发病。这些结果表明所建立的间接ELISA方法可用于棉子携带黄萎病菌的快速检测。     

小麦赤霉病菌定性和定量ELISA检测方法的建立

以3株小麦赤霉菌(禾谷镰刀菌BDX4-5,BDX3-2,HwH4-5)的混合菌体蛋白为免疫原,制备多克隆抗体,建立了检测小麦赤霉菌的间接ELISA法。结果表明,小麦赤霉菌抗血清的效价为1∶640 000,灵敏度为0.005μg/mL。由ELISA法测定的结果可知,此抗体可以与镰刀菌发生特异性反应,而与其他供试的病原真菌的菌体蛋白呈阴性反应。对田间人工接种的小麦籽粒进行了ELISA定量测定,病菌的生物菌量与病害的发病程度相符合。     

陕西关中地区棉花黄萎菌营养亲和性研究

 由于陕西关中地区的泾阳菌系被定为致病性最强的生理Ⅰ型,本试验采用营养亲和性的方法对陕西关中地区采集的18个菌株以及陕西省植保所提供的新疆和田菌系、陕西泾阳菌系和河南安阳菌系进行了研究。经不同氮源利用的鉴定,结果为：21个菌株共获得364个nit突变株,其中nit1 289个,占总量的79.40%;nitM 72个,占总量的19.78%; nit3仅有3个。经营养体亲和性配对测试,21个菌株可分为3个营养亲合群(VCGs)。 新疆和田菌系属于亲合群2(VCG₂),河南安阳菌系属于亲合群3（VCG₃）。其余的18个菌株属于亲和群1(VCG₁)。B18没有产生突变体。且发现不同菌株营养体亲和产生的亲和带形态有差异,且具一定稳定性。由此可见, 造成陕西关中地区棉花黄萎病发生严重并造成经济损失的主要原因是由于主要致病菌属于VCG₁。     

新疆棉花黄萎菌不同致病类型的RAPD指纹分析

用 RAPD- PCR技术 ,对采自新疆各地的 2 7个棉花黄萎菌株的遗传分化及致病性进行了研究。从 1 2 0个随机引物中筛选出 1 1个随机引物 ,共在 2 0 4个位点上扩增出 RAPD谱带 ,其中 1 88个为多态性位点 ,占 92 .1 6%。RAPD电泳条带差异表明 ,新疆棉花黄萎病菌种群内部存在着显著的遗传分化。对 RAPD谱带进行聚类分析 ,将 2 7个菌株划分成 3大类群 ,这 3大类群与根据鉴别寄主反应划分的不同致病类型有一定的相关性 ,RAPD谱带差异与菌株的地理分布也有一定的联系     

一种检测棉花黄萎菌毒素致萎性的新方法-叶片针刺涂抹法

用针在棉花叶片表面0.5 cm2的面积上刺15~20个小点,然后将黄萎菌毒素溶液涂抹于针刺部位,观察记载处理部位的萎蔫程度,由此检测黄萎菌毒素对棉花致萎性的强弱。利用层析纯化的黄萎菌V991毒素对棉花的致萎性试验表明:棉苗的子叶为最佳接种部位,毒素对陆地棉感病品种鄂荆3号的致萎下限为7.3μg,接种24 h即可表现萎蔫症状。用8个不同致病力黄萎菌系的培养滤液(简称滤液)针刺涂抹3个不同抗病性陆地棉品种,同时设置相应毒素浸泡参比试验。结果表明,利用培养滤液,即可以快速、准确地检测滤液的致萎力强弱,该方法既可用于棉花品种资源对黄萎病的抗性鉴定,又可用于比较黄萎病菌的不同生理型。     

猪流行性腹泻病毒N重组表达蛋白间接ELISA检测方法建立

为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本184份,总阳性率为68.5%。     

温度胁迫对棉花黄萎-病菌致病力的影响

在不同温度条件下对棉花黄萎病菌同一菌株进行继代培养至11代,试验结果表明温度对棉花黄萎病菌的致病力有明显的影响.无论在何种温度条件下(15～30℃)均表现随着培养代数的增加,病原菌的致病力先有减弱趋势,而后又逐渐回升.高温胁迫对病原菌致病力的影响较明显,30℃条件下培养至11代,病原菌的致病力明显高于对照,即较高温度较长时间的选择压力,使病原菌的致病力明显提高.温度对病原菌的室内培养特性也有影响,随着温度的升高,菌株产生菌核减少.     

新型选择性培养基检测土壤棉花黄萎病菌效果初报

介绍了一种用于检测土壤棉花黄萎病菌的选择性培养基。该培养基成份为：鲜棉叶100g,蔗糖5g,琼脂17~20g,40%PCNB0.3g,氯霉素、链霉素和青霉素各0.05g,水1000ml,pH6.4~7.0。该培养基与其它常见分离培养基相比,成份简单、操作简便,检测率显著,抑菌效果好,病菌在其上生长快、菌落典型,是一种较为理想的选择性分离培养基。     

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株抗菌蛋白初步分析

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有较强的抗生作用。通过对NCD-2菌株培养条件的研究,结果表明在30℃、培养液初始pH为7.0和培养时间为2 d条件下,利用NB培养基培养该菌株所得培养液抑菌活性优于其他培养基,其培养液经硫酸铵沉淀所得的蛋白粗提液经RNA酶处理后的抑菌活性与对照相比差异不显著,经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后的抑菌活性与对照相比差异显著;蛋白粗提液经60℃处理后的抑菌活性与对照相比差异不显著,经80,100,120℃处理后抑菌活性与对照相比差异显著,但经120℃处理30 min后仍有一部分抑菌活性,研究结果说明该菌株产生的抗菌物质存在性质上的差异。     

棉花黄萎病菌安阳菌系致病类型变异研究

以国内外有代表性的菌系为对照,３ 个不同棉种的４ 个品种为鉴别寄主研究了棉花黄萎病菌安阳菌系致病类型的变异。结果表明,安阳菌系的致病力类型有明显变异,其ＡＶＳ菌株的致病力明显强于强致病力类型的陕西泾阳菌系和我国江苏落叶型菌系ＶＤ－ ８,且略高于美国强致病力落叶型菌系Ｔ－ ９,属强致病力类型;病原菌室内培养性状也有变异,ＡＶＳ菌株是近年出现的新类型,其在病株中分离比例呈上升趋势,ＡＶＨ菌株在病株中的分离比例则呈下降趋势;黄萎病的田间症状有不同类型,早期落叶型为近年出现的新类型,具有发病早、重、快、损失重等特点;早期落叶型棉花黄萎病的致病菌与ＡＶＳ菌株关系密切。     

酸不可溶性木质素和漆酶在棉花抗黄萎病中的作用

以抗病海岛棉Pima 90-53、耐病陆地棉冀棉20和感病陆地棉邯208为材料,研究黄萎病菌胁迫下棉花细胞壁的组织结构和木质素含量与棉花抗性的关系,并分析参与木质素合成的胞外漆酶的基因表达水平。结果发现,室内接种黄萎病菌24 h,在Pima 90-53的根部导管组织中没有发现病原菌的侵入,而在冀棉20和邯208的导管组织均有病原菌侵入;接种35 d时,Pima 90-53的茎部导管细胞壁高度木质化且导管堵塞不明显,冀棉20的导管细胞壁中度木质化且导管堵塞不明显,而邯208的导管细胞壁仅发生轻度木质化且导管堵塞严重。对田间病圃种植棉花叶片和叶柄的测定发现,3个品种的酸不可溶性木质素含量与品种的病情指数呈显著负相关(r = 0.99991^*),酸不可溶与可溶性木质素的比值大小与棉花品种黄萎病抗性强弱表现一致。基于此,进一步采用Real-time PCR技术分析参与木质素合成的漆酶基因GhLaccas表达差异发现,在冀棉20接种病菌后各检测时间点的表达量均显著高于邯208,且在冀棉20中GhLaccase表达量较0 h升高9~14倍,在8 h达到最高并在72 h内一直维持较高水平,表现出较高的应答效率。以上结果表明酸不可溶性木质素含量与黄萎病抗性呈正相关,漆酶在棉花抗黄萎病过程中起着重要作用。     

石房蛤毒素酶联免疫吸附测定方法的研究

建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法(idc-ELISA)测定石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)。采用碳化二亚胺法,将半抗原STX分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联,得到免疫抗原STX-OVA和包被抗原STX-BSA。用STX-OVA免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。确定的最佳包被抗原质量浓度为2μg/mL,多抗的工作浓度为1∶800,羊抗鼠二抗工作浓度为1∶1 000。回归方程Y=0.136 6X-0.015 1,R2=0.990 1。该方法的灵敏度达到5.8μg/mL,检出范围在0.2～926μg/mL。     

大丽轮枝菌拮抗细菌的分离与抗菌物质鉴定

从黄萎病发病棉田未发病棉株根际土样中分离芽孢杆菌,利用对峙培养法对大丽轮枝菌进行平板拮抗实验,筛选出6株对大丽轮枝菌有拮抗作用的芽孢杆菌,其中3株菌发酵代谢产物具有抗菌活性。S4-3菌株发酵液滤液经100℃、30min热处理丧失抗菌活性,发酵液氯仿抽提物不具有抗菌活性,发酵液硫酸铵沉淀物有抑菌活性,但经蛋白酶处理后活性丧失,认为S4-3菌株抑菌活性物质是蛋白质。而菌株S4-5发酵液经100℃热处理后还有较高的抗菌活性,发酵液氯仿抽提物也具有抗菌活性,但硫酸铵沉淀物对病原菌无抑制作用;S5-6菌株发酵液滤液经100℃热处理丧失抗菌活性,硫酸铵沉淀物也不具有抗菌活性,而发酵液氯仿抽提物有抗菌活性,因此认为S4-5和S5-6菌株产生的抑菌物质不是蛋白质类。     

几种氨基酸铜对大丽轮枝菌产生毒素蛋白的影响

用几种氨基酸铜溶液处理大丽轮枝菌,阴离子交换层析分离培养液中的毒素蛋白,并进行棉苗的致萎实验,比较了各氨基酸铜制剂对大丽轮枝菌毒素蛋白产生的影响。实验表明,丙氨酸铜、甘氨酸铜、谷氨酸铜和复合氨基酸铜都在一定程度上抑制了大丽轮枝菌微菌核的形成和毒素蛋白的分泌,而苏氨酸铜促进了毒素蛋白的分泌。说明复合氨基酸铜的抑菌作用是各成分协同作用的结果。     

杀虫剂累计施用量对棉株衰老及黄萎病抵抗能力的影响

以常规棉和抗虫棉为材料研究了大田棉铃虫中度——重度发生情况下,杀虫剂对棉株衰老和抗黄萎病能力的影响。结果表明,杀虫剂累计用量超过一定值后,叶绿素含量、可溶性蛋白含量降低,抗氧化系统酶类活性下降,活性氧积累,膜脂过氧化加剧,促使棉花早衰,抗黄萎病能力下降。