禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。     

J亚群禽白血病病毒的免疫荧光检测效果

应用特异性抗J亚群禽白血病病毒（ALV－J）的单克隆抗体JE9建立了免疫荧光检测ALV－J抗原和抗体的方法。结果表明，在ALV－JADOL－Hcl感染鸡胚成纤维细胞（CFF）24小时后，可以用1FA检测出阳性细胞，感染72小时后，可以检测出最小病毒感染量≥1．25TCID50／孔。对人工感染ALV－J鸡肾脏冰冻切片检测结果证明，免疫荧光法可以检测出组织中的ALV－J抗原，表现强阳性反应。用重组病毒rBac4817－env感染的Sf9细胞作抗原，可以检测出鸡血清中抗ALV－J的特异性抗体。该方法在ALV－J的控制中必将产生重要作用。     

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165 μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。     

F亚群禽白血病病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测F亚群禽白血病病毒(ALV-F)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,本研究以ALV-F分离株FGD1803基因组为模板,PCR扩增其env基因,构建重组质粒pMD18-T-F作为标准品.利用该重组质粒建立了 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法(qPCR)的标准曲线,并经反应条件优化建立了检测...     

应用荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒

针对J亚群禽白血病病毒（ALV-J）基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒作为阳性标准品,建立了检测ALV-J核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如A亚群禽白血病病毒（ALV-A）、B亚群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、鸡传染性贫血病毒（CIAV）和马立克病病毒（MDV）均不发生交叉反应;该方法可检测到3.2×102拷贝/μL的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR 检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于ALV-J的定量检测。     

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)ELISA检测方法的建立

利用抗J亚群禽白血病病毒（ALV—J）囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9，建立了检测ALV—J env抗原抗体免疫复合物的ELISA方法。应用该方法检测SPF鸡血清、鸡抗禽流感H9亚型阳性血清、鸡沙门氏菌阳性血清、鸡腺病毒阳性血清、鸡新城疫阳性血清．结果均为阴性，无交叉反应；抗ALV—J阳性血清与ALV—J特异性单克隆抗体JE9能相互阻断；ALV—J阳性血清经酸处理后，ELISA检测的D490差值明显下降。对部分攻毒鸡血清样本及田间ALV—J阳性血清样本进行电镜观察，可见ALV—J样病毒粒子及ALV—J样免疫复合物。经与间接免疫荧光（IFA）检测ALV—J env抗体结果比较表明，建立的ELISA方法与IFA方法两者具有较好的群体符合率，群体符合率为8／9。这些结果表明，本研究建立的ELISA方法在ALV—J的诊断中具有很好的应用前景。     

A、J亚群禽白血病病毒感染肉用种鸡的诊断

通过流行病学调查、剖检病变和组织病理学观察,结合PCR技术检测病原核酸,确诊肉用种鸡群发生了由ALV—A和ALV—J感染而导致的淋巴细胞性白血病和骨髓细胞瘤型白血病。在检测的6只病鸡中,6只病鸡均感染了ALV—J,2只病鸡感染了ALV-A.     

肉种禽网状内皮增生症、鸡传染性贫血和禽白血病血清学调查

对不同种鸡场不同周龄肉种鸡进行REV、CAV和ALV（A、B亚群）抗体检测。在572份血清样品中，除了一个8．1周龄和15周龄鸡群CAV抗体阳性率分别为13．3％和75％外，其它鸡群无论是否进行CAV疫苗免疫，抗体阳性率均为100％。在212份血清样品中，REV抗体阳性率在16．7％～62．5％之间；ALV（A、B亚群）抗体阳性率在0％～75％之间。本研究结果表明，所检测种鸡群中存在3种免疫抑制性病毒的感染或混合感染。     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

禽流感病毒HA基因的分子克隆和测序

血凝素（HA）是禽流感病毒诱导机体产生保护性体液免疫反应的主要靶抗原。本研究的目的是克隆HA基因，为以后的表达及基因工程疫苗的研制奠定基础。收获接毒鸡胚的尿囊液，超速离心沉淀病毒，采用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，利用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术扩增出禽流感病毒（H9N2亚型）血凝素的cDNA。PCR产物加A尾后，用玻璃奶试剂盒回收纯化目的片段，通过T－A连接将加尾PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-T easy vector，转化DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定，对目的片段进行测序，结果获得了HA基因全长，约1．7kb，与已知序列进行同源性比较，同源性最高的可达97％，所克隆的基因为禽流感HA基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

禽白血病病毒J亚群(ALV-J)基因表达与抗原定位的研究

本研究通过原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)技术检测了组织中ALV-J病毒RNA的表达及定位。原位杂交结果显示：在攻毒后3周时．所检测到的组织大部分已感染病毒；病毒对肝脏、心脏、肾脏的实质细胞、骨髓髓系细胞和卵巢基质中的间质细胞、脾脏红髓内的单核-巨噬细胞有较高的嗜性．在核膜及胞浆内显示出蓝紫色颗粒状的特异性信号，而在法氏囊、胸腺、脑和坐骨神经中检测不到病毒RNA及病毒基因的表达。免疫组化结果与原位杂交相似，在核膜及胞浆内可见蓝紫色阳性信号．瘤组织的信号较强，显示了较强的抗原性。由骨髓和其他组织的结果可推测ALV-J诱导肿瘤可能和病毒基因的插入位点有直接关系，而和病毒在组织内的数量没有直接关系。     

检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法的研究

分别用绿猴肾细胞和鸡胚成纤维细胞殖鸡传染性鼻气管炎病毒NL7784株，提纯抗原建立了检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），试验的最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：160，酶标抗体为1：1000稀释，待检血清为1：160稀释，包被液为pH9．0的碳酸盐缓冲兴，6％犊牛血清（CS）作封闭液，稀释液用含10％CS的Tween－20磷酸盐缓冲液，洗涤液用含0．5％Tween－20的磷酸盐缓冲液，抗原与抗体的最佳反应时间为30分钟，底物的反应时间为15分钟。与中和试验进行了比较，证明所产方法具有很好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性。     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

鸡白血病病毒抗原ELISA试剂盒的研制和应用

以双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）为基本原理，成功地研制出鸡白血病病毒抗原ＥＬＩＳＡ试剂盒，该试剂盒与国外同类试剂盒相比，具备相同的特异性和敏感性，对ＲＡＶ－１纯化样品的最小检出量可达０．７８ｕｇ／ｍｌ，且敏感性高于直接补体结合试验。经初步应用发现，我国商品种鸡群ＡＬＶ阳性率为０．７－１４％，在部分ＳＰＦ鸡群中未检出阳性鸡。     

禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）和鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的检测方法,本研究根据GenBank中AIV的M基因和ChPV的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测。通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致。本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对AIV和ChPV的防制具有重要意义。