鸭圆环病毒无核定位信号衣壳蛋白的原核表达及其在间接ELISA中的应用

鸭圆环病毒(DuCV)是一种具有长期免疫抑制特性的病原体,其Cap蛋白是DuCV的主要结构蛋白和主要免疫保护抗原,构成病毒的核衣壳,对DuCV的血清学诊断具有重要意义。为了开发出适合DuCV的检测方法,本研究在重组Rosetta大肠杆菌细胞内对无核定位信号的DuCV Cap蛋白进行了表达,建立了基于无核定位信号Cap蛋白检测DuCV血清抗体的间接ELISA方法(Cap-ELISA)。结果：Cap-ELISA包被抗原的最佳浓度为280 ng/孔,血清稀释比为1∶1 600;检测样本的阴阳临界值为0.339,灵敏度达到1∶12 800,并对DuCV抗体检测具有特异性;与常规PCR方法的符合率为92.7%,用Cap-ELISA对山东部分地区的樱桃谷鸭血清进行了间接ELISA检测,总阳性率为88.9%,说明该方法适合在DuCV血清学诊断中应用。     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达与鉴定

为获取猪圆环病毒3型衣壳蛋白(PCV3-Cap蛋白),本试验参照PCV3 HBBD1810毒株(GenBank登录号：MK105924)的基因组序列信息合成cap基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a中,对重组质粒进行测序和双酶切鉴定后,将重组质粒转化Rosetta大肠杆菌,对最佳IPTG诱导浓度和诱导表达时间筛选,并对目的蛋白表达后的存在形式进行检测以及对纯化条件进行筛选,透析复性后利用鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体进行Western blot以验证目的蛋白的反应原性。结果显示,通过构建原核表达系统获得大小为42 kDa的PCV3-Cap蛋白;破菌处理后目的蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中;0.2 mmol/L IPTG 37℃下诱导培养8 h后蛋白表达量较高;在300 mmol/L咪唑洗脱时纯化出清晰条带;经过Western blot验证目的蛋白能够被鼠源抗PCV3-Cap单克隆抗体识别,具有良好的反应原性。结果表明,本试验成功构建了PCV3-Cap蛋白表达载体,成功表达PCV3-Cap蛋白,同时优化了表达和纯化条件,为PCV3亚单位疫苗的研制以及检测试剂盒的开发和研究提供...     

鹅圆环病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)抗体的检测方法,本研究通过原核表达重组核衣壳(Cap)蛋白,将纯化的该重组蛋白作为ELISA检测的包被抗原,利用交叉反应性,以羊抗鸡IgG(HRP-IgG)作为二抗,经反应条件的优化,建立了检测鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法。确立的ELISA反应最适条件为:抗原包被浓度为2.05μg/mL,待检血清稀释度为1∶50,HRP-IgG稀释度为1∶2000,待测血清和二抗均于37℃反应1.5h,底物于室温显色10 min。经38份阴性血清检测确定阴阳性临界值为0.25。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌、新城疫、禽流感H5和H9、小鹅瘟、鹅副粘病毒抗原阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数均小于10%。应用该方法检测了从4群GoCV PCR检测阳性种鹅群采集的血清,结果显示其血清阳性率在60.0%～90.9%。本实验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,为进一步开展GoCV流行病学调查提供了一种便捷可靠的手段。     

猪圆环病毒1型和2型衣壳蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白基因(Cap)分别设计一对引物,利用PCR方法从已知的PCV1和PCV2中各扩增到一条DNA片段.将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pCAP-PCV1和pCAP-PCV2,并分别转化大肠杆菌BL21.序列测定表明,所克隆的序列大小均为579 bp,其中PCV1的cap基因与GenBank中的U49186序列一致,PCV2的cap基因与DQ104422序列一致.通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证明携带重组质粒pCAP-PCV1或pCAP-PCV2的大肠杆菌均可以表达融合蛋白形式的衣壳蛋白(分别命名为GST-CAPl和GST-CAP2,分子量约为49 ku).通过免疫小鼠制备了GST-CAP1和GST-CAP2多价血清,并通过dot-ELISA进一步证明了PCV1与PCV2的抗原交叉性.猪圆环病毒衣壳蛋白的表达,将为临床检测PCV抗体提供诊断抗原以及为研制PCV单克隆抗体提供材料.     

PRRS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的高效表达

用表达非融合蛋白的原核表达载体pBV220，通过PCR技术的引物设计对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒BJ-4株核衣壳蛋白（N）基因起始密码子上游进行了改造和修饰，成功地构建了含有PRRS病毒N基因的原核重组表达载体pBV-N。pBV-N转化大肠杆菌DH5α，温度诱导后菌体裂解物经SDS-PAGE分析发现，在约15000处出现1条诱导前后的pBV220载体对照和诱导前的pBV-N中均缺少的特异性的蛋白条带，分子量大小与PRRS病毒N蛋白相符，并随着诱导时间的延长而变化，在诱导后4h达到高峰。薄层扫描结果显示，重组N蛋白表达量最多可占菌体总蛋白的27.4%。Western-blotting检测，此15000的蛋白带可为PRRS病毒N蛋白的单克隆抗体所识别，表明该重组N蛋白具有良好的抗原性。     

犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以犬冠状病毒(CCV)TN449株为对象,对CCV核衣壳蛋白(N蛋白)编码基因进行克隆和原核表达,通过使用纯化的重组N蛋白,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组N蛋白具有良好的CCV抗原反应性;经优化ELISA反应条件,确定重组N蛋白最佳包被浓度为1.0μg/m L、待检血清的最佳浓度为1∶100、阴阳性判定临界值为0.418;通过对比检测犬瘟热等多种犬病阳性血清,未发生交叉反应,证实该间接ELISA方法特异性好;用建立的间接ELISA方法对本室保存的50份CCV阳性血清和阴性血清进行复检,证实其符合率为100%。     

抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组犬瘟热病毒(CDV)N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A_4C_6C_(12)和A_5B_8H_7。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10~6、1:10~5;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型;Western blot和ELISA分析结果显示2株单克隆抗体均能与重组N蛋白和CDV发生反应,而与犬细小病毒及犬腺病毒等无交叉反应;ELISA叠加试验的增值结果表明两株单克隆抗体识别的抗原位点不同。特异性抗CDV-rN的单克隆抗体的获得,为进一步用于临床诊断研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

试验通过RT-PCR法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因并克隆到原核表达载体pet-30a中,转入到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物的特性。利用Ni柱纯化该重组蛋白,采用NC膜皮下包埋法免疫Balb/C小鼠,取免疫后的脾细胞与SP2/0细胞进行融合后筛选杂交瘤细胞株,检测杂交瘤细胞株的特性并制备单克隆抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,该重组蛋白表达正确,约为20 ku,能被抗PRRSV的阳性血清特异性识别。超声后用Ni柱纯化,经SDS-PAGE分析可得单一的目的条带。NC膜皮下包埋法免疫效果良好,通过细胞融合、ELISA筛选获得3株能稳定分泌抗PRRSV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株(H7、F7、C8),制备出高特异性的针对N蛋白的H7单抗。IFA与Western blotting结果显示制备的单抗可与病毒N蛋白产生特异性反应。亚型鉴定为IgG2b型,染色体分析证实杂交瘤细胞染色体数目正确。结果成功实现了N蛋白的原核表达,并获得高特异性的单克隆抗体,为PRRSV N蛋白抗原的检测奠定基础。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化

目的：本研究基于原核表达系统表达猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）Cap蛋白。方法：PCV-2 ORF2基因编码的Cap蛋白含有能产生免疫反应的多个抗原表位,本研究针对Cap蛋白基因设计引物,去掉核定位信号肽的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,筛选重组菌并进行原核表达、鉴定及纯化。结果：纯化后的修饰Cap蛋白是能够与猪圆环病毒Ⅱ型的阳性血清发生特异性反应。结论：表达的重组修饰Cap蛋白可以作为标准抗原蛋白用于PCV-2的检测。     

非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术，从含非洲猪瘟（ASFV）P72基因的克隆质粒BBBBPr4中扩增出1．94kb的P72基因．将P72基因和表达栽体pET-30c（＋）分别用限制性核酸内切酶Fba Ⅰ／XHoⅠ和BamHⅠ／XHoⅠ进行双酶切，然后在T4DNA连接酶作用下，将P72基因定向克隆至栽体pET-30c（＋）中相应位点上，并转化至宿主菌BL21（DE3）中，得到了重组菌株BL21（DE3）（pET—ASFvP72）。经PCR鉴定，构建的重组菌株中合有P72基因。重组菌株BL21（DE3）（pET-ASFVP72）经IPTG诱导后，其表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明衣壳蛋白P72基因可以在受体菌中高效表达，达到了菌体总蛋白的34％，表达产物的分子量约为78Ku，并能被ASFV抗体所识别。     

犬瘟热病毒F1蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达和鉴定犬瘟热病毒(CDV)F1蛋白,本研究通过RT-PCR扩增了CDV HLJ2-07株F1基因,并将其克隆至pET-30a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得大小约为47.5ku以包涵体形式表达的F1重组蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白31.5%。Western blot分析表明,表达产物能够被兔抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。间接ELISA检测表明,重组蛋白与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒及犬波特氏杆菌等疾病的阳性血清无交叉反应。本研究为进一步建立检测CDV抗体间接ELISA方法及研制F1蛋白亚单位疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

对含有已构建的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET-ORF2s的BL21菌进行诱导表达,纯化重组蛋白包涵体,Western-blot检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,建立可检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。用该方法对吉林省多个种猪场收集的179份血清样品进行检测,总阳性率为42.5%。由此说明,本试验建立的PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,适用于大规模猪场血清学检测。     

Expression and antigenicity characterization for truncated capsid protein of porcine circovirus type 2

Three pairs of specific primers were designed to amplify F2-1, F2-2, and XF2-2 truncated capsid protein genes of porcine circovirus type 2 (PCV-2). Amplified sequences were subcloned to pET-32a(+) vectors and expressed in Rosetta (DE3) Escherichia coli by induction of isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG). All of the fusion proteins had positive reactions to PCV-2 antiserum and His-XF2-2 showed the best reactivity. Proteins were used to immunize BALB/c mice to produce monoclonal antibodies (mAbs), and 7 mAbs were selected. Capsid protein N-terminal parts 55 to 96 amino acid (aa), 97 to 141 aa, and 143 to 211 aa were confirmed as binding regions of the 7 mAbs. Reactivity between His-XF2-2 and the 7 mAbs was detected, FmAb-8 showed the best reactivity. The dominant B-cell epitope was located at 97 to 141 aa. The PEPSCAN indicated that the P122-136 peptide contained the dominant B-cell epitope.     

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10.这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1:2 048 000、1:512 000、1:1 024 000、1:512 000、1:1 024 000;其中1D2、2E8、5F2和6F10单抗亚类为IgG2a,仅3A10为IgG1;2E8、3A10、5F2和6F10单抗轻链为入型,仅1D2轻链为K型.Western blot结果显示,这5株单抗中2E8、3A10、5F2和6F10可与自然PCV2-Cap发生反应,而1D2无反应.IPMA和抗原捕获ELISA结果表明,ID2单抗可与PCV2病毒蛋白发生反应,而与PCV1无交叉反应;病毒中和试验证实,1D2单抗具有中和活性,是一株针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗.这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段.     

重组猪IFN-α原核表达及其活性分析

为了表达猪重组α干扰素(rIFN-α)并对它的生物学特性进行研究,本研究采用RT-PCR从猪脾淋巴细胞中扩增出猪IFN-α基因,以pPROExHTa为载体构建了表达重组质粒polFN-α,转化宿主菌BL21,经IPTG诱导猪rIFN-α获得了表达,其分子量约22 ku.该重组蛋白以包涵体形式存在,其表达量占总菌体蛋白7%.粟用Ni-Ni金属螯合亲和层析方法纯化,其纯度达到80%以上,包涵体经复性后,在WISH/VSV系统上,采用细胞病变抑制法测定表明,其稀释度在小于1:103时才有抗病毒活性.本实验表达的猪rIFN-α具有一定的抗病毒活性,为研究具有广谱抗病毒效应的猪干扰素具有重要意义.     

基于Fosmid文库平台快速构建PRV、PCV-2和CSFV多联疫苗及其应用研究

随着集约化、高密度养殖的迅速发展,生猪养殖遭受各种传染病暴发的困扰,严重影响了养猪业的发展。其中猪伪狂犬病、猪瘟和猪圆环病毒病是危害养猪业健康发展的主要疾病,三者在临床中常常混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。我国广泛采用疫苗接种的方法来控制上述传染病,为了降低免疫成本、减少免疫次数,研制“一针防多病”的多联疫苗显得格外重要。其中利用活病毒载体构建同时表达多种抗原蛋白的多联疫苗是抵抗传染病混合感染的有效策略。     

绵羊肺腺瘤病病毒NM株衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病病毒内蒙（NM）株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增编码gag基因衣壳蛋白（Capsid protein,CA）基因,构建CA蛋白的重组表达质粒pGEX-4T-1-CA,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入Ecoli BL21 CodonPlus中,在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以可溶性和包涵体形式高效表达,表达的CA融合蛋白表观分子量约为37 Ku,表达量占全菌蛋白的20%,利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。本研究为下一步利用重组蛋白研制绵羊肺腺瘤病病毒NM株的单克隆抗体及诊断试制盒等奠定了基础。