猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白间接ELISA诊断方法的建立和应用

以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型（PCV-2）重组结构蛋白（rCap蛋白）为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测方法进行特异性试验、临床应用试验;组装试剂盒并进行试剂盒保存期试验。优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.815 μg/mL,抗原最佳包被条件为37 ℃ 2 h;血清最适稀释度为1∶40,酶标抗体最适稀释度为1∶500,最佳封闭液为1% BSA;阴阳性临界值判定标准为D450 nm≥0.33,判为阳性,D450 nm＜0.33,判为阴性。特异性试验结果表明,只有PCV-2阳性血清反应后的D450 nm＞0.33,包括抗PCV-1阳性血清在内的其他5种抗血清反应后的D450 nm＜0.33,说明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。经对临床疑似PCV-2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为69%。组装试剂盒在4 ℃条件下至少可保存12个月以上,说明所建立的诊断方法可以在生产中大量推广应用。本研究成功建立了能特异性检测抗PCV-2血清抗体的ELISA检测方法。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用

为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法的建立

为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。     

鸭坦布苏病毒包膜蛋白的原核表达和间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立特异性和敏感性高的检测鸭坦布苏病毒感染的方法,采用原核表达系统对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因进行了克隆与表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白大小为54.3 ku.Western blot结果表明,经亲和层析法纯化后的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法.对ELISA各种反应条件进行了优化,确定了最适工作条件.优化后确定的抗原最适包被浓度为7 μg/mL,血清的最佳稀释度为1;320,酶标抗体最适稀释度为1:1 000.在优化条件下,阴性和阳性临界值判定标准为0.324 4.本研究建立的快速检测DT-MUV抗体的间接ELISA方法为该病的检测和流行病学调查提供了技术手段.     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体检测ELISA方法的建立

为建立快捷的含病毒隐孢子虫的检测方法,本研究利用已构建的微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白重组表达质粒表达并纯化重组蛋白,建立以该重组衣壳蛋白为包被抗原检测抗体的间接ELISA检测方法.经优化后间接ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为0.25 μg/孔,被检血清稀释度为1:200,酶标二抗稀释度为1:2000,封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST溶液.该方法检测安氏隐孢子虫阳性血清,柔嫩艾美尔球虫阳性血清,蓝氏贾第虫阳性血清,弓形虫阳性血清与微小隐孢子虫阳性结果均为阴性.该方法灵敏度为1:1600,特异性较强且具可重复性,可用于含病毒隐孢子虫的抗体检测及流行病学调查.     

猪脑心肌炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立与应用

以猪脑心肌炎病毒VP1重组蛋白为抗原,建立了检测猪脑心肌炎病毒(EMCV)血清抗体的间接ELISA诊断方法。经优化后抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清最适稀释度为1∶50,其作用时间为90 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min。判定标准为OD450≥0.427为阳性,OD450≤0.35为阴性,介于二者之间为可疑。该重组蛋白与PRRSV、猪瘟、PCV2、FMDV抗体反应呈阴性,证明具有良好的特异性。应用该方法检测了来自我国不同地区的26家猪场的156份临床血清,结果证明我国部分规模化猪场已有猪脑心肌炎疾病存在。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)血清抗体的间接ELISA方法,构建了高效表达PHEV核衣壳蛋白(N)的重组质粒(pET28a-N),Western blot检测该重组蛋白具有较好的免疫原性。以纯化的N重组蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2mg/L,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶10 000,建立了用于PHEV抗体检测间接ELISA方法。此外,用该法(N-ELISA)对天津市地区采集到的200份猪血清样品进行检测,阳性检出率为83.5%,与前期工作中建立的全病毒作为包被抗原的间接ELISA诊断方法 (HEV-ELISA)检测结果的符合率为90.91%。结果表明:以重组N蛋白为包被抗原所建立的用于PHEV血清抗体检测的方法能够用于检测PHEV感染及相关的流行病学调查。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

两种绿头鸭肌肉营养成分分析及评价

本试验旨在研究两种绿头鸭（白羽绿头鸭和绿头鸭）肌肉营养组成和价值,为绿头鸭肉产品的开发利用提供基础数据和理论依据。选择白羽绿头鸭和绿头鸭60只（每个品种各30只,公母各半）,依照国家标准测定胸肌粗蛋白质、粗脂肪、胆固醇含量及氨基酸、脂肪酸、微量元素和维生素的组成和含量,并对胸肌进行氨基酸评价及脂肪酸营养价值评价。结果显示,白羽绿头鸭肌肉粗蛋白质含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;两种绿头鸭肌肉中均检测到17种含量大于0.01%的氨基酸,其中白羽绿头鸭肌肉苏氨酸、组氨酸、丝氨酸和脯氨酸含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,赖氨酸、谷氨酸和精氨酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到13种含量均大于0.01%的脂肪酸,其中白羽绿头鸭硬脂酸和油酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到9种矿物质元素（钠、镁、钾、钙、锰、铁、铜、锌和硒）,两种绿头鸭差异不显著（P>0.05）;检测到8种维生素,白羽绿头鸭肌肉维生素B₁含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,维生素D和维生素E含量显著低于绿头鸭（P<0.05）。两种绿头鸭肌肉氨基酸比例接近世卫组织推荐的理想模式,富含人体所需的矿物质元素和维生素,具有广阔的开发利用前景。     

Prevalence of diseases of the spinal cord of cats

A retrospective review of records of 205 cats with histologically confirmed disease of the spinal cord was performed to identify the prevalence of disease in this nonrandomly selected population of cats. Clinical records were reviewed, and age, duration of neurologic illness, and clinical and histopathologic findings in cats with spinal cord disease were abstracted. Disease processes were classified into 7 categories and 23 groups. The most common diseases affecting the spinal cord of cats were feline infectious peritonitis (FIP), lymphosarcoma (LSA), and neoplasia of the vertebral column secondarily affecting the spinal cord. Information on age, onset and duration of clinical signs, and lesion localization at the postmortem examination in cats belonging to the 7 categories of disease were analyzed to create a practical list of differential diagnoses. Cats were also subcategorized into 3 groups based on their age at death. FIP was the most common disease of cats younger than 2 years of age. LSA and vertebral column neoplasia were the most common diseases affecting cats between 2 and 8 years of age. Vertebral column neoplasia was the most common disease affecting cats older than 8 years of age. Results of this histopathologic study showed that FIP and LSA were the most common disease processes affecting the spinal cord of cats. However, at least 21 other groups of diseases and their relative prevalence were identified.     

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留量的不确定度评定

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》建立了高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留测量的不确定度评定方法,评定过程包括建立测量程序、分析不确定度来源、对不确定度分量进行量化。将不确定度归类为两大类。随机效应导致的不确定度可以通过一系列具有统计意义的重复观测值进行A类评定;系统效应导致的不确定度通过各测量器具、设备的说明书、校准证书提供的参数进行B类评定。本方法鸡肉中土霉素残留量的相对合成标准不确定度约为3.9%。     

几个柑橘品种实生苗的抗旱性评价研究

以5个金柑属品种、枳壳、软枝酸橘及广西土柠檬实生苗为材料,进行复水成活率、旱害指数、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸等生理指标及隶属函数的综合分析,为柑橘抗性砧木品种选育提供参考。结果表明：胁迫20d复水后的成活率融安滑皮金柑和长寿金柑最高,为100%,软枝酸橘最低,为88.9%;随着干旱胁迫加剧,各品种的旱害指数呈上升趋势,长寿金柑的旱害指数最低,为0.25,软枝酸橘的旱害指数最高,为0.61;从叶片相对含水量的结果来看,长寿金柑的变化幅度最小,软枝酸橘的变化幅度最大,在第18d时分别为61.19%和37.85%;3种保护酶之间相互协同作用减轻植株受害程度,其活性变化幅度与丙二醛和脯氨酸的含量变化相似。利用隶属函数法综合分析,得出各品种的抗旱性强弱依次为长寿金柑>枳壳>融安滑皮金柑>融安金柑>山金柑>广西土柠檬>金枣>软枝酸橘。