兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白基因(fimN)序列设计了一对引物,扩增出大小为648bp的目的基因片段,建立了快速检测兔支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌均无交叉性反应。用该PCR法检测了从杨凌、咸阳采集的50份表现临床症状的兔呼吸道分泌物检出支气管败血波氏杆菌阳性35例,阳性率为70%。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较,结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的3.89倍,是微量凝集法的1.94倍。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR快速检测方法的建立及应用

参考GeneBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因序列设计了一对特异性引物,扩增出大小为387bp的目的基因片段,优化PCR反应条件,建立了兔支气管败血波氏杆菌的PCR快速检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、魏氏梭菌和巴氏杆菌均无交叉反应,且检出最低浓度为10pg,可用于临床检测。     

应用16S rRNA基因测序法鉴定兔支气管败血波氏杆菌的研究

应用16S rRNA基因测序法对兔支气管败血波氏杆菌Bb-1株进行了16SrRNA基因序列分析。结果表明,能够扩增出与预期结果相符合的片断。经Blastn比较,分离菌与兔支气管败血波氏杆菌RB50株（BX640449）同源性为99．8％。进一步的生化实验鉴定表明,Bb-1株生化反应结果符合兔支气管败血波氏杆菌生化反应特征。综合各种实验结果表明,分离菌Bb-1株为兔支气管败血波氏杆菌。     

兔支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

应用16S rRNA基因测序法对兔支气管败血波氏杆菌标准株和分离的5株波氏杆菌进行了16S rRNA基因序列分析。结果表明,5株分离菌与标准株同源性在99.4%~100%之间。后经Blast分析各分离株与已发表的32株波氏杆菌同源性均在98%以上。进一步的生化试验鉴定表明标准株与分离菌株生化反应结果均符合兔支气管败血波氏杆菌生化反应特征。综合各种试验结果表明5株分离菌株均为兔支气管败血波氏杆菌。     

兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定

山东莱州某兔场饲养有2000只种兔,2007年4月份起,部分兔出现打喷嚏、流鼻涕现象;有的病兔被毛蓬松,精神不振;2~3 d后,有的病兔鼻孔发现有粘液性或脓性分泌物,呼吸困难。全场发病率约45%;发病期间,每天死亡2~5只不等,多为40日龄左右幼兔,病死率约10%。笔者对送检病兔通过病原分离鉴定和生物学特性试验,确诊为兔支气管败血波氏杆菌感染。现将试验情况报告如下。1材料与方法1.1材料①病料:山东莱州某兔场送检的病兔。②培养基:鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、马丁肉汤,按常规方法自制。③生化发酵管:购自山东省卫生防疫站。④药敏试验纸片:购自…     

兔支气管败血波氏杆菌病的诊治

兔支气管败血波氏杆菌病是由支气管败血杆菌引起的一种呼吸道传染病，此病在自然界广泛传播，尤其是在气候多变季节，幼年兔发病率与死亡率较高。特征是慢性鼻炎、咽炎和支气管肺炎。仔兔、青年兔多呈急性型，成年兔呈慢性型。我们对哈尔滨郊区某实验兔场进行流行病学调查过程中，发现一种以鼻炎和肺炎为特征性的疾病，经综合诊断，证实该病为兔支气管败血波氏杆菌病。现将具体情况报告如下。１发病情况及临床症状２０００年下半年，此兔场经常发现有的病兔从鼻腔中流出粘性分泌物，鼻周围及前爪湿润并染脏，打喷嚏，食欲不振，被毛粗乱，肌…     

猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立

对表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离得到的34株支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb),采用针对Bb flagellum gene的一对引物进行PCR扩增,结果所有分离物均能扩增出237bp特异性DNA条带,与传统生化鉴定结果相一致,且其最小检出量为0.64pg;而猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌及大肠埃希氏菌均未能出现任何DNA条带。这表明,本试验建立的PCR方法具有特异性强、灵敏度高、可靠性好等特点,可用于猪萎缩性鼻炎的临床诊断。     

副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的副猪嗜血杆菌(Hps)检测方法。针对Hps16S rRNA基因保守区域设计6条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,对模板DNA进行梯状等温扩增,并且优化LAMP的反应体系,检验其灵敏性与特异性。结果表明:该方法对Hps的最小检测限为0.2pg/μL,灵敏性高于常规PCR方法103倍;完成反应仅需65min。该方法灵敏度高、特异性好,能够作为Hps的快速诊断方法,对于基层和实验室应用均具有良好前景。     

犬细小病毒LAMP检测方法的建立

为提高犬细小病毒(CPV)的检出率,降低检测成本,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种新型敏感、特异、快速、简便、实用的检测CPV的技术。针对CPVVP2基因保守区设计6条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,并检测其敏感性、特异性。所建立的方法最佳反应时间为60min,具有良好的特异性,与同属的其它病毒无交叉反应。该方法对CPV的最低检出量为9.3×10-5ng/μL,其敏感性是PCR的100倍。结果表明,该方法特异性强、敏感性高,并且操作简便、检测成本低,检测时间短,在CPV的综合防治和早期诊断方面具有很高的实用价值。     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

研究针对布鲁杆菌保守的OMP25基因设计了4条LAMP的特异性引物,通过优化反应条件,建立了布鲁杆菌的LAMP快速检测方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测布鲁杆菌,其最低检测限为5 copies/μL.扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行判定.LAMP可以快速、直观、准确地检测布鲁杆菌,是一种适合基层现场应用的检测方法.     

动物园野生动物支气管败血波氏杆菌的分离鉴定与系统发育树的构建

采用Biolog和16SrRNA基因序列分析法对分离自北京动物园的8株支气管败血波氏杆菌进行了鉴定。菌株经纯化培养,用Biolog微生物鉴定系统进行了鉴定,结果表明,8株菌株为支气管败血波氏杆菌。菌株经纯化培养,采用菌落PCR方法进行16SrRNA基因序列扩增,扩增产物纯化后直接进行测序。序列经人工校对后用ClustalX1.83软件进行比对分析,最后用Mega3.1软件构建系统发育树,系统发育分析结果表明,8株菌株与支气管败血波氏杆菌DSM10303的同源性达到了99.9%,并在同一个分支内。     

快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价

利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验.结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果.在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1 CFU/g.在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应.试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求.     

猪支气管败血波氏杆菌PCR诊断方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）鞭毛蛋白基因的上游序列设计了1对引物flal和fla2，扩增出大小为237bp的目的基因片段，建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明，该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和D型多杀性巴氏杆菌均无交叉性反应；最低能够检出112．5pg的模板DNA。用该PCR法检测了从延边州采集的48份表现不同临床症状的猪鼻黏液；结果，检出支气管败血波氏杆菌阳性42例，阳性率为87．5％。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较；结果显示，该PCR法的检出率是细菌检查法的5．25倍，是微量凝集法的1．75倍。     

快速诊断伪狂犬病毒的LAMP方法的建立

采用LAMP技术建立了一种针对伪狂犬病毒的可视、快速、灵敏、特异的检测方法。应用PrimerExplorerV4软件,根据伪狂犬gE基因的保守序列设计了4条引物,优化了反应体系与反应时间,检测了特异性与灵敏性。发现该方法只需要40 min就能检测出结果,具有良好的特异性,灵敏度为普通PCR的100倍,最低可检测出质量浓度为6.2×10-9mg/L的病毒DNA。该方法的建立为伪狂犬病的快速诊断提供了新的思路。     

环介导等温扩增技术在动物病原检测中的应用

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种依赖于自动循环的链置换技术,在等温条件下,不到1h就能扩增出10^9-10^10靶序列拷贝。该技术快速准确、操作简单、特异性强、灵敏度高,已经被用于动物病原微生物的快速检测。本文就LAMP法的反应原理、技术特点及其在动物病原快速检测中的应用作一综述。     

刺激隐核虫LAMP检测方法的建立

为提高大黄鱼刺激隐核虫病的病原体检出率,本研究针对刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans) 18S-ITS2基因序列设计4条LAMP引物,在内外引物浓度比2∶1～6∶1、Mg2+浓度2 mmol/L、反应温度61℃～66℃、反应时间60 min的优化条件下,扩增产物经电泳后呈现特异性的LAMP梯形条带.本研究建立的LAMP方法具有高灵敏度(10-7 ng/μL DNA浓度),比常规PCR方法高100倍.将该方法应用于采集自不同地域的虫体样本、病鱼和水样以及不同组织样品的检测,结果在13份样品中有10份检出阳性,并显示该方法既能够检测发病鱼,也能够检出已感染但未发病的鱼.实验表明,该方法是一种能够快速、简易、特异、敏感地检测海水鱼类刺激隐核虫病的病原学检测方法.