花青素合成调节基因B1/C1转化东方百合'索邦'的研究

百合是全球著名的切花商品花卉,较低的遗传转化效率限制了百合转基因育种的发展,建立高效、稳定的遗传转化体系对于培育转基因新品种至关重要。外源花青素合成调节基因的表达可使花青素在植物细胞内积累, 使植物体外观上表现出色彩的变化,易于观察, 因此可作为报告基因用于植物转基因研究,快速报告细胞、组织、器官或植株是否被转化。本文以东方百合‘索邦’无菌苗鳞片为受体材料,利用农杆菌介导法将花青素合成调节基因B1/C1导入‘索邦’中。通过草甘膦敏感性试验,确定了草甘膦筛选的质量浓度为2.1 mg/L,对农杆菌介导的遗传转化体系进行了优化,研究了侵染液及共培养基成分对抗性芽诱导率的影响,以MS培养基为基本培养基,设置了7种类型改良MS培养基。结果表明:当MS培养基中去除大量元素时,抗性芽获得率相对较高,可达(18.31±1.71)%。在此条件下,将培养基中30 g/L的蔗糖替换成70 g/L的麦芽糖,可使抗性苗诱导率增至(22.27±3.48)%。热激和超声波结合使用能够明显提高抗性苗的获得率,其中以42 ℃热激1.5 min、120 W超声波超声20 s抗性苗获得率最高,可达(26.80±2.24)%。抗性植株经PCR和Southern检测,获得了1株单拷贝转基因植株,初步证明B1/C1基因已整合到‘索邦’基因组DNA中,并且转基因植株叶片、叶柄、鳞茎的花青素含量均高于非转基因植株,说明花青素合成调节基因B1/C1在转基因百合中获得了表达。      

索邦和西伯利亚百合的离体再生体系建立

【目的】确定索邦（Sorbonne）和西伯利亚（Siberia）百合的离体再生体系适合的诱导培养基、增 殖培养基、生根培养基以及最佳转化受体系统。【方法】选用索邦和西伯利亚百合的鳞茎球作为外植体,比较 它们在添加不同激素配比的培养基中的生长状况,得出两种百合诱导愈伤组织和不定芽、继代增殖、诱导生根 培养基和对卡那霉素敏感的最适条件。【结果】索邦百合最佳诱导培养基是 MS+2,4-D 1.5~2.0 mg/L,西伯利亚 百合最佳诱导培养基为 MS+2, 4-D 1.0~1.5 mg/L;两种百合的最佳继代增殖培养基均为 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L：两种百合的最佳生根培养基为 1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L;筛选转化植株时,质量浓度为 150 mg/L 的卡那霉素足以抑制非转化细胞或细菌的生长。【结论】为东方百合品种种球工厂化生产及遗传转化再 生体系充实理论依据。     

3种东方百合离体培养

【目的】研究3种东方百合离体培养技术,筛选出适宜其离体培养的统一培养基,为东方百合工厂化育苗提供技术保障。【方法】以3种东方百合提伯、索邦和西伯利亚的鳞片为外植体,筛选适宜的灭菌方法;在MS基本培养基上添加不同种类和不同浓度的激素,筛选适宜的增殖培养基和生根培养基,进一步筛选最适移栽基质。【结果】适宜3种东方百合外植体灭菌的较好方法是:75%酒精灭菌15 s结合升汞灭菌12 min;愈伤诱导和分化的适宜培养基为MS;MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA是增殖培养的最适培养基,提伯、索邦和西伯利亚的增殖系数分别为3.32、3.32和3.00;MS+0.1 mg/L IBA是生根培养的最佳培养基,提伯、索邦和西伯利亚的生根率分别为96.33%、92.67%和93.67%;移栽的最佳基质为泥炭∶珍珠岩(体积比)=2∶1,提伯、索邦和西伯利亚的移栽成活率分别为97.34%、98.00%和100.00%。【结论】建立的3种东方百合离体快繁体系适用于东方百合种球工厂化生产。     

百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测

目的百合是世界上主要的商品花卉之一,具有很高的观赏价值和经济价值,然而目前的主栽东方百合品种耐旱和耐盐碱性较差,对其进行改良是提高百合价值的关键因素。方法对已获得的含抗逆相关基因P5CS-F129A的东方百合‘索邦’单拷贝转化株系L89和双拷贝株系L31进行了4年的组培继代培养和1年的温室栽培,检测了目的基因的稳定性和干旱胁迫处理下的表型和生理指标的变化。经Southern印迹杂交和cDNA检测显示目的基因能够稳定遗传。结果干旱胁迫处理结果表明:两个转基因株系叶片脯氨酸含量均高于普通‘索邦’,其中株系L31的脯氨酸水平最高;虽然干旱胁迫下两个转基因株系和普通‘索邦’叶片相对电导率均有所升高,但转基因株系叶片的相对电导率低于普通‘索邦’,重新灌水后,转基因株系恢复正常水平,普通‘索邦’未恢复;在表型性状等方面,经过胁迫并复水的株系L89和L31总体长势良好,两株系之间长势无显著差异,而普通‘索邦’叶片黄化严重,生长受阻。结论转P5CS-F129A基因植株具有更强的耐旱性和遗传稳定性,对抗逆性百合新品种的培育具有重要意义。      

3种百合组培快繁体系的优化

为优化百合组培快繁体系,以东方百合‘索邦’、野生淡黄花百合及新铁炮百合‘雷山3号’为研究对象,采用组织培养技术,研究不同外植体诱导分化、组培苗继代增殖和鳞茎增大的最佳培养条件。结果表明:淡黄花百合种子萌发的适宜培养基为MS+0.01 mg/L NAA+60 g/L蔗糖;适宜‘索邦’、‘雷山3号’鳞片诱导不定芽的适宜培养基分别为MS+2.0 mg/L 6–BA+0.3 mg/L NAA和MS+0.5 mg/L 6–BA+0.2 mg/L NAA;适宜这3种百合组培苗增殖培养的培养基为MS+2.0 mg/L 6–BA+0.2 mg/L NAA;适宜‘索邦’无菌苗鳞茎增大的培养基为3MS+0.5 g/L AC+3.0 mg/L PP333+80 g/L蔗糖。     

东方百合“索邦”离体培养技术探索

[目的]研究东方百合＂索邦＂的离体培养技术。[方法]以东方百合＂索邦＂的鳞片为外植体,考察了不同激素浓度配比和鳞茎不同部位对不定芽诱导的影响。[结果]以MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA培养基诱导出芽效果最好,其诱导率为60%。鳞茎不同部位诱导出芽的能力依次为中部〉外部〉内部,并将诱导出的不定芽转接到生根培养基（1/2MS＋0.1 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA＋0.2%活性炭）中,其生根率可达100%。[结论]东方百合＂索邦＂离体再生体系的建立对于减少我国对进口百合种球的依赖,扩大国产百合的生产有着重要的意义。     

几种百合花粉生活力测定及贮藏条件研究

以2种野生百合(山丹、有斑百合)、3种切花百合(西伯利亚、索邦、白天堂)和1种栽培百合(兰州百合)为材料,采用离体萌发法测定花粉生活力,研究花粉萌发最适的培养条件和保持花粉活力最适的贮藏条件。结果表明,西伯利亚和索邦最适培养基配方为5%蔗糖+20 mg/L H3BO3,有斑百合和兰州百合为15%蔗糖+20 mg/L H3BO3,山丹为5%蔗糖+10 mg/L H3BO3,白天堂为10%蔗糖+80 mg/L H3BO3;除有斑百合外,其他百合均在室内散射光照射下花朵完全开放时萌发率最高;低温贮藏有利于保持花粉的活性,-20℃条件下贮藏1年,各百合花粉均有一定生命力。     

百合组织培养技术研究

以百合西伯利亚和索邦的茎尖、鳞片为试材,研究了培养基类型、激素浓度、活性炭对百合苗生长的影响。结果显示:茎尖分化的适宜培养基为MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L和MS+BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,诱导鳞片产生不定芽的适宜培养基为MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L,西伯利亚的分化率高于索邦;百合继代增殖的适宜培养基为MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;添加活性炭可提高生根率。     

4 种观赏百合的组培快繁技术研究

以观赏百合莫娜、黄天霸、巴巴拉、索邦等4个品种的鳞片为材料进行组培快繁技术研究。结果表明:用75%酒精消毒10 s,0.1%升汞消毒10 min,再用无菌水清洗5次的灭菌效果最好,污染率最低;MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L为最佳诱导培养基;MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L为最佳增殖培养基;MS+IBA 0.5 mg/L为最佳生根培养基;蛭石∶黄心土=1∶1为最佳移栽基质。整套组培快繁技术在莫娜、黄天霸、巴巴拉、索邦等4个观赏百合品种中均适用。     

东方百合‘索邦’的离体培养研究

东方百合‘索邦’作为市售主流鲜切花百合品种,具有巨大的市场潜力。为满足市场需求,利用花器官作为初始材料,对东方百合‘索邦’离体培养涉及的愈伤组织诱导、丛生芽增殖及生根培养等相关技术进行研究。结果表明,子房为合适的初始诱导外植体,进一步扩繁诱导愈伤组织时适宜选用叶片下部或鳞茎片为外植体,合适的愈伤组织诱导培养基为MS+2.0 mg·L^-1 2,4-D+0.2 mg·L^-1 6-BA +30 g·L^-1 蔗糖+6.5 g·L^-1 琼脂,pH 5.8。丛生芽增殖培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA +30 g·L^-1 蔗糖+6.5 g·L^-1 琼脂,pH 5.8。生根培养基为MS+0.5 mg·L^-1 NAA +30 g·L^-1 蔗糖+6.5 g·L^-1 琼脂,pH 5.8。结果为进一步完善东方百合‘索邦’的离体培养体系,进行优质种球的规模化生产提供基础。