农杆菌介导的番茄遗传转化研究进展

介绍了农杆菌介导的番茄遗传转化影响因素,包括番茄的基因型、农杆菌类型、外植体类型、预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、分化培养基中的生长调节剂与抗生素浓度、筛选剂浓度、乙酰丁香酮浓度及外源基因等重要因素。同时综述了番茄转基因技术的应用及研究成果,以期为农杆菌介导的番茄遗传转化奠定理论基础。     

不同启动子驱动的ACDS基因对矮牵牛遗传转化技术研究

以矮牵牛为试材,通过根癌农杆菌介导ACC脱氨酶基因(ACDS)(分别由CaMV35S、SAG12和CHSA启动子驱动)转化矮牵牛叶盘,探讨了预培养时间、农杆菌菌液浓度、浸染时间、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对转化的影响,比较了ACDS基因在不同启动子驱动下获得转基因植株的效率及转基因植株的生长速率。结果表明:预培养5d的矮牵牛叶盘在含AS 200μmol·L-1、OD600值为0.6的农杆菌菌液中浸染8min后,共培养4d时遗传转化效果最优;不同启动子驱动的ACDS基因转化效率以CHSA启动子效率最高(3%),SAG12启动子效率最低(1.25%)。PCR检测证明外源基因已整合进入矮牵牛基因组中。转ACDS基因矮牵牛植株的获得,为利用基因工程技术培育抗衰老矮牵牛新品种奠定了技术基础。     

阔叶猕猴桃遗传转化技术参数的优化

为了提高阔叶猕猴桃的遗传转化效率,以阔叶猕猴桃叶柄为试材,通过根癌农杆菌介导法进行了遗传转化技术参数的研究。结果表明,叶柄预培养3～4d、用农杆菌悬浮液(D600nm值0.5)感染10min、共培养48h、共培养时在培养基中加入200μmol/L乙酰丁香酮处理可以获得较高的gus基因表达率。在供试的1200个叶柄中获得了49个抗性芽,转化频率为4.1%。对转基因抗性材料进行PCR检测和gus基因组织化学染色,证实了外源基因已整合到阔叶猕猴桃的基因组中,并得到稳定表达。     

根癌农杆菌介导的桃幼胚转化实验参数研究

以桃幼胚作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过对GUS基因瞬时表达率的分析,研究此转化体系的最佳实验参数。实验结果表明,预培养时间、感染时间、共培养时间和根癌农杆菌诱导物AS等对转化效率都有一定的影响。预培养1d、感染15min、共培养42h和不添加AS时GUS瞬时表达率最高。     

新疆甜瓜高效再生体系的建立及NPR1/HRP双价抗病基因转化

以厚皮甜瓜5d龄无菌苗子叶为外植体,MS和1/2MS为基本培养基,研究了添加6-BA、IAA和卡那霉素不同浓度,进行甜瓜再生体系与根癌农杆菌介导的转化体系的建立。结果表明:甜瓜子叶最适宜的不定芽分化培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.3mg/L,芽伸长培养基为MS+6-BA 0.75mg/L+IAA 0.3mg/L,生根培养基为1/2MS+IAA 0.3mg/L,适宜的转化条件为外植体预培养48h,农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀=0.3～0.4,侵染时间为15min,22℃暗培养48～55h。经75mg/L的卡那霉素筛选,共获得再生甜瓜幼苗21株,其中8棵经PCR鉴定证明NPR1/HRP双价抗病基因已经整合到甜瓜基因组中,即转化率为38%。     

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立

 通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究, 建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明, 农杆菌侵染叶片外植体效率最高; 外植体预培养不利于农杆菌的侵染; 乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外, 菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后, 经过抗性芽的诱导、根的再生, 70 d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southern blot检测, 外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中, 转化频率为7%～8%。     

根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立

 在建立北海道黄杨(Euonymus japonicus 'Cu zhi')再生体系的基础上,建立其遗传转化体系,以获得转雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)基因植株。采用根癌农杆菌(Agrrobacterium tumefaciens)　( LBA4404菌株)介导法,研究影响北海道黄杨遗传转化的若干因素。结果表明,预培养与否、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定的影响。在遗传转化过程中,不经预培养,根癌农杆菌浓度OD₆₀₀ = 0.6,侵染下胚轴40 min,再共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率。抗性植株经PCR和DNA-Southern blot检测表明,目的基因已整合到北海道黄杨基因组中。     

根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化的若干因素。结果表 明:西瓜子叶块外植体对潮霉素较为敏感,15 mg/L是适宜的筛选浓度,可明显抑制非转化组织的生长;脱菌过程中 采用500 mg/L的头孢霉素,对外植体生长影响较小;农杆菌菌株EHA105对西瓜子叶块的侵染能力较强;预培养有 利于转化;共培养3-4 d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600值为0.3的菌液侵染10min效果最 佳;共培养培养基中添加乙酰丁香酮可提高转化频率。     

Agrobacterium-mediated Transformation by Mature Embryo of Wheat Ningmai 13

宁麦13是目前生产中应用面积较大的弱筋小麦品种,以此品种建立农杆菌介导的成熟胚遗传转化体系有助于对该品种的个别性状进行针对性改良。本研究利用分别携带不同质粒pCXK1301和pAt-MYB12u的农杆菌株系GV3101对宁麦13成熟胚愈伤组织进行转化,通过对预培养时间、共培养时间和干燥处理等参数的研究,建立了农杆菌介导的宁麦13成熟胚遗传转化体系。宁麦13成熟胚转化体系的条件为：利用预培养6d的宁麦13成熟胚愈伤组织作为转化受体,使用含pAtMYB12u质粒的农杆菌株系GV3101,侵染菌液浓度OD600=0.6,侵染时间60min,采用干燥共培养4～5d（23℃,暗培养）,诱导恢复培养10d,分化培养每4week继代一次,分化培养8week（12h光周期,25℃,2 000lx）。试验侵染2 600个宁麦13愈伤组织,获得127株再生植株,经分子检测,其中9株证实为阳性转化植株。     

发根农杆菌诱导毛酸浆毛状根条件的优化

以4种发根农杆菌A4、C58C1、R1601、ATCC15834为诱导菌株侵染毛酸浆叶片、茎段,研究了发根农杆菌种类、外植体类型、不同预培养时间、不同侵染时间、不同共培养时间和乙酰丁香酮对毛酸浆毛状根诱导率的影响,并用PCR检测rolB基因。结果表明:4种发根农杆菌均能诱导毛酸浆外植体产生毛状根,ATCC15834的诱导率相对较高,叶片优于茎段;最佳侵染时间为6~8min;预培养和共培养时间均为2~3d时诱导率较高;乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol·L~(-1)有利于促进毛状根的产生,经PCR检测证明,rolB基因已整合到毛酸浆毛状根基因组中。