山东新城疫病毒分离株F基因的遗传进化分析

应用特异性引物从山东某发病鸡场病鸡体内分离到的命名为JN09的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)中扩增其F基因,预计扩增片段大小为1 700 bp. RT-PCR扩增出的目的片段大小与预计扩增片段大小相符合,测序结果表明扩增片段与新城疫病毒F基因序列相符.对其F基因进行遗传进化分析,并结合山东地区近几年来的分离毒株的相关信息,着重分析该地区近年来新城疫病毒 F基因的变异情况.     

山东新城疫病毒分离株F基因的遗传进化分析

应用特异性引物从山东某发病鸡场病鸡体内分离到的命名为JN09的新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）中扩增其F基因,预计扩增片段大小为1 700 bp。RT-PCR扩增出的目的片段大小与预计扩增片段大小相符合,测序结果表明扩增片段与新城疫病毒F基因序列相符。对其F基因进行遗传进化分析,并结合山东地区近几年来的分离毒株的相关信息,着重分析该地区近年来新城疫病毒F基因的变异情况。     

新城疫病毒基因组中F基因的研究进展

新城疫病毒（NDV）的分类位置，据国际病毒分类委员会（ICTV）报告归列于副粘病毒亚科的Avulavirus内，由NP、P、M、F、HN、L等六种基因组成，其中F基因是病毒毒力强弱和免疫原性的主要决定因素之一，是业界研究的热点。     

6株鸽源新城疫病毒广西分离株F基因的遗传演化分析

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的6株鸽源新城疫病毒F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示:只有1株分离株F基因的ORF全长为1 659 bp,编码552个氨基酸,其他5株分离株F基因的ORF全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,6株分离株的F0蛋白裂解位点的序列均为112RRQKRF117,符合强毒株的序列结构特性;核苷酸同源性比较显示,6株分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高,为91.3%~99.3%(与比利时分离株11(JX901124)的同源性最高),与其他基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型毒株的同源性在81.3%~89.2%。与经典强毒株F48E9相比,核苷酸序列同源性为83.6%~84.8%,氨基酸序列同源性为89.2%~92.4%;与Ⅰ型疫苗株V4、I-2相比,核苷酸同源性分别为83.6%~85.1%和82.6%~84.2%,氨基酸序列同源性分别为88.1%~91.3%和87.7%~90.8%;与Ⅱ型疫苗株La Sota和B1相比,核苷酸同源性分别为81.7%~83.9%和82.0%~83.9%,氨基酸序列同源性分别为86.6%~89.9%和86.6%~89.9%。遗传进化分析显示,6株广西鸽源分离株与2011年比利时分离株11(JX901124)和中国毒株SDS、LLN713、BJP13、LJL404、P4的遗传关系最为接近,位于同一进化树分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

鸡新城疫病毒河北分离株F基因的分子特性分析

通过毒力测定、RT-PCR及F基因的序列测定与遗传进化分析,对2005-2008年从河北省部分地区的发病鸡群中分离到的10株新城疫病毒（NDV）进行了研究。各分离株经典毒力测定结果显示：MDT在37.6～54.4h之间,ICPI在1.71～2.0之间,IVPI值在2.16～2.8之间,均为新城疫病毒强毒株特征。F基因的序列测定表明,分离株之间的核苷酸序列具有77.4%～98.0%的同源性,与疫苗株Lasota的同源性为87.0%～98.9%,与国内标准强毒株F48E9同源性为89.7%～98.9%。推导其氨基酸序列分析表明,8个分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112 R-R-Q-K-R-F117,具有NDV强毒株特征,与毒力测定结果相符,2个分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112 G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株特征相符。F基因分型和同源性比较显示：目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主（占70%）,同时兼有基因Ⅱ型（占20%）和基因Ⅸ型（占10%）。     

新城疫病毒载体研究进展

随着反向遗传学操作技术的发展,重组新城疫病毒载体成为当今病毒载体系统研究的热点之一.论文在综述了新城疫病毒的安全性评价、分子生物学特性的基础上,着重介绍了以新城疫病毒作为病毒载体表达外源基因应用于基础研究、疫苗研究和作为基因治疗载体等研究概况.     

新城疫病毒长春株F基因和HN基因的序列分析

从长春地区分离到一株新城疫病毒,经过对其进行生物学研究表明该毒株具有新城疫病毒弱毒株的一些特性,本试验通过ＲＴ－ＰＣＲ方法测定出该毒株Ｆ基因的核苷酸序列为１７５８ｂｐ,编码有５３３个氨基酸残基;ＨＮ基因核苷酸序列为１７３１ｂｐ,编码５７７个氨基酸残基,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较。Ｆ基因核苷酸序列的同源性在８８．２％～９６．７％之间,氨基酸序列同源性在９０．１％～９     

表达鸡传染性支气管炎病毒S基因的重组新城疫病毒构建

为构建以新城疫病毒(NDV)为活毒载体表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S基因的重组病毒,本研究利用RT-PCR技术,以IBV的Massachusetts41株RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到IBV S基因(3534bp),将其插入到NDV感染性克隆pBRN-FL中,构建了含有IBV S基因的重组NDV cDNA克隆pBRN-FL-IBVS。利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,将pBRN-FL-IBVS转染表达T7聚合酶重组痘病毒感染的BSR细胞,救获重组NDV(rL-IBVS)。采用RT-PCR检测接种重组病毒的鸡胚尿囊液,结果表明rL-IBVS中含有相应外源基因。IFA试验表明,rL-IBVS可与鸡抗IBV的高免血清发生特异性反应,证明S蛋白在感染的BSR细胞中得到表达。其鸡胚平均致死时间、脑内致病指数和静脉内致病指数等指标显示rL-IBVS保持了亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病力特性。本研究采用反向遗传操作技术构建了表达IBV S蛋白的重组NDV,为进一步研制IBV和NDV的重组基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2对引物，对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定，其基因序列全长均为1662bp，编码553个氨基酸，均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV参考株的F基因序列进行了比较。结果表明，核苷酸序列的同源性为82．6％～98．1％，氨基酸的同源性为87．7％～98．7％。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(^112R—R—Q—K／R—R—F^117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明，10株NDV广西分离株中GX1／00、GX2／00、GX4／00、GX6／02、GX7／02、GX9／03、GX10／03和GX11／03为基因Ⅶd亚型，GX3／00和GX5／00为基因Ⅲ型。     

新城疫病毒云南分离株F基因变异特性分析

采用RT-PCR技术对云南2007年-2009年采集的948份喉气管拭子或组织样品中新城疫病毒F基因进行检测,获得阳性样品65份,选择30份代表性阳性样品采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,新城疫病毒云南分离株F基因核苷酸与疫苗LaSota株之间的同源性为70.5%～99.8%,与F48E9株之间的同源性为70.7%～90.8%。系统发育分析表明,30株病毒中21株属于基因型Ⅶ,裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F,与传统认为强毒裂解位点氨基酸序列相同;7株属于基因型Ⅱ,5株裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R-L,属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征,2株裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F属于强毒裂解位点氨基酸序列;2株病毒与9个基因型的同源性差异较远。     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增子人起始密码子开始的１．８ｋｂ新城疫病毒（ＮＤＶ）血凝素－神经氨酸（ＨＮ）基因开放式阅读框（ＯＲＦ），然后插入ｐＴＫ２Ｂ的Ｎｂｅ１位点，构建了含ＮＤＶＨＮ基因的插入载体ＰＴＫＨＮ１和ＰＴＫＨＮ２，将其与感染火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）细胞的总ＤＮＡ共转民纤维细胞（ＣＥＦ），经有限稀释法和Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ筛选，得到含有ＨＮ基因的重组体ｒＨ     

一株鸭源新城疫病毒强毒株的分离与初步鉴定

从表现腹泻、神经症状、肠道粘膜局部出血、坏死以及卵泡充血、出血为特征的病死产蛋鸭分离到一株病毒,经血凝（hemagglutinin,HA）、血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）和血清中和试验（seium neutralization,SN）及部分融合蛋白（F）基因的序列测定初步鉴定为新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）,命名为JSD0812株。该毒株10日龄SPF鸡胚平均死亡时间（mean deathtime,MDT）为54．6h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数（intracerebral pathogenicity index,ICPI）为1．75,6周龄SPF鸡静脉接种指数（intravenous pathogenicity index,IvPI）为2．68,其F蛋白裂解位点氨基酸序列为^112R—R—Q—K—R—F^117,上述结果符合NDV强毒株的分子特征,证实该毒株为NDV强毒株。致病性试验表明该毒株对鸡、鸭和鹅均有很强的致病性．     

鹌鹑对新城疫病毒的易感性试验

用从新城疫病死鹌鹑中分离的新城疫病毒(NDV)株(QNDV-1)和鸡新城疫毒株(F_(48)E_8),对5日龄、10日龄、25日龄、35日龄和70日龄等不同日龄鹌鹑进行了感染试验,并用15日龄鹌鹑做了呼吸道、肌肉注射、皮下注射、脑内注射、静脉注射和消化道等不同途径的感染试验。结果表明:供试不同日龄鹌鹑均可被感染发病,并出现和自然病例同样的症状或死亡,随着日龄增长,死亡率有降低趋势,70日龄鹌鹑(成年产卵)出现同自然病例同样的产卵量下降和产出异常卵现象;不同途径均可使鹌鹑感染发病或死亡,其中以脑内注射和静脉注射所表现的发病或死亡最为急剧;从病死鹌鹑中可重新收回到新城疫病毒,发病耐过鹌鹑可产生特异性抗体。     

密码子优化增强新城疫病毒DNA疫苗的表达水平和免疫效果

为提高新城疫病毒（Newcasti Disease Virus,NDV）F基因DNA疫苗的表达量,增强其免疫效果。按照鸡体内偏嗜性密码子人工合成了NDV F48E9株的F基因optiF,插入到真核表达载体pVAX1中获得pVAX1-optiF。将F48E9株的F基因pVAX1-F与pVAX1-optiF分别转染COS-7细胞,72h后间接免疫荧光和Western blot检测细胞中瞬时表达的F蛋白。将质粒pVAX1、pVAX1-F和pVAX1-optiF以200μg／只的剂量分别股四头肌多点注射18只2周龄SPF鸡,2周后加强免疫1次,同时设立PBS对照。二免2周后每组取12只鸡以100EID50的F48E9株NDV强毒进行攻毒,评价这2种DNA疫苗的免疫效果。结果表明,F基因密码子的优化可显著提高NDVDNA疫苗诱导的保护性体液免疫和细胞免疫应答水平,攻毒后所有pVAX1-optiF免疫鸡均获得保护（12／12）,而pVAX1-F组保护率只有17％（2／12）。DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量及表达抗原的免疫原性有直接关系。与未经修饰的F基因相比,修饰后的F基因体外瞬时表达水平明显提高。     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

2006～2008年华东地区新城疫病毒HN基因序列分析

为研究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的HN（血凝素-神经氨酸酶,hemagglutinin—neuraminidase）基因分子流行病学规律,利用RT—PCR扩增了2006～2008年间分离自我国华东地区的43株NDV的HN基因片段。基因序列分析显示,分离株中基因Ⅰ型2株,基因Ⅱ型3株,基因Ⅵ型1株,其它37株都属于基因Ⅶd亚型。根据遗传发生进化树可将基因Ⅶd亚型进一步分为Ⅶd1和Ⅶd2两个亚型,基因Ⅶd1亚型HN蛋白的第102、118、443位氨基酸分别为T,A和T,而基因Ⅶd2亚型则分别为I,E和M。另外,研究表明HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势。     

CpG寡核苷酸增强鸡新城疫疫苗免疫效力的研究

为了探讨CpG寡核苷酸（CpG oligonucleotide,CpG ODN）对鸡新城疫疫苗免疫效力的影响,将CpG2007与鸡淋巴细胞共孵育,测定淋巴细胞增殖率,结果发现CpG2007对鸡淋巴细胞具有显著的刺激活性。将CpG2007与不同浓度的新城疫抗原混合,制备灭活疫苗,免疫健康雏鸡。分别于免疫后不同时间采血,测定抗体效价和细胞因子表达量,并进行攻毒保护试验。结果发现,添加CpG ODN佐剂的试验组均比对应相同抗原剂量的免疫对照组的抗体水平高,产生抗体速度快;抗原剂量降低10倍的佐剂试验组与高抗原剂量免疫对照组抗体水平和攻毒保护率均相当,表明CpG ODN能显著增强新城疫疫苗的免疫效力,能促进机体产生更强烈的免疫应答,是有效的疫苗佐剂候选物质。     

鸽新城疫野毒株的分离及生物学特性研究

对分离的Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３３株鸽新城疫病毒进行了电镜检查、致病性指数测定、血凝试验（ＨＡ）,与鸡新城疫Ｌａｓｏｔａ毒株的交叉血凝抑制试验（ＨＩ）、致病性试验。测得鸡胚半数感染量（ＥＩＤ５０）分别为１０－８．４１,１０－７．５３,１０－７．８３;鸡胚最小致死量（ＬＤ）均为１０－４;鸡胚平均致死时间（ＭＤＴ）分别为８０ｈ,９０ｈ,９６ｈ;１日龄雏鸡脑内致病指数（ＩＣＰＩ）分别为１．６０,１．５０,１．５５;分离毒株与Ｌａｓｏｔａ毒株和其相应血清的交叉凝集抑制试验有明显差异。将分离毒株分别接种１月龄鸽各３只,４～１０ｄ全部出现典型神经症状,１５ｄ内死亡。结果表明所分离的３株病毒为鸽新城疫病毒,在抗原性上与鸡新城疫病毒存在一定差异,对鸡也有一定致病力。为制定防制措施,研制鸽新城疫疫苗,控制新城疫流行提供了科学依据。     

ClassI新城疫病毒强毒株融合蛋白的表达时相分析

根据ClassI新城疫病毒分离株9a5b编码序列,设计特异性引物扩增融合蛋白（F）基因截短片段（199～1500nt）,利用原核表达获得重组蛋白,切胶免疫Balb／c小鼠,制备特异性多抗血清,利用制得的血清进行F蛋白表达时相分析。结果表明：NDV9a5b病毒按5M．0．1（multiplicityofinfection,多重感染复数）感染量接种DF1单层细胞,经IFA检测,在感染6h时,F蛋白开始出现,主要分布于细胞浆内;12～16h胞浆申的F蛋白含量逐渐增多,形成包涵体,开始在细胞膜上分布;当病毒感染24h后,F蛋白在细胞膜上形成明显的膜周染色;至感染36h后,出现多个细胞融合的包涵体,细胞已基本崩解。此时,F蛋白也散在分布于包涵体中。这为深入开展F蛋白与该病毒的毒力演化机制研究工作奠定了基础。     

华东地区健康水禽携带新城疫病毒情况调查

近年来,新城疫逐渐成为了一种严重的家养水禽疾病。尽管如此,目前对于我国水禽新城疫的流行和分布情况依然知之甚少。本研究采集了2011-2012年中国华东6省1市的部分活禽市场和养殖场表观健康家鸭和家鹅泄殖腔棉拭样品,进行新城疫病毒的分离和毒力检测工作。通过测定分离株F基因高变区nt47-420,对其进行遗传进化分析。结果显示,在1200份样品中,检测到阳性样品23份,分离率为1．92％,表明眼观健康家鸭和家鹅中携带新城疫病毒。对比寒冷的春冬两季和炎热的夏季,新城疫病毒的分离率存在明显的差别。在中国家鸭和鹅中流行的新城疫毒株依然对温度敏感,高温天气不利于新城疫疫情蔓延。对分离株的鸡胚平均死亡时间和脑内接种指数进行了测定。参考76株GenBank中已发表并鉴定基因型毒株的F基因高变区nt47～420,对23株家养水禽分离株进行了遗传进化分析,结果发现分离株与流行的强毒株和疫苗株遗传距离较远。其中,13株与ClassII基因Ib亚型遗传距离最近;3株属于ClassI基因2型;7株与ClassI基因3b亚型遗传距离最近。