蓖麻毒蛋白A链基因克隆与重复表达载体构建

利用降落PCR的方法,从蓖麻基因组DNA中克隆毒蛋白A链基因的560bp片段;利用一步法将该基因的2个正义片段和2个反义片段分别与pBI-121质粒连接,构建含该基因的正义重复和反义重复表达载体,为利用共抑制技术抑制蓖麻毒蛋白A链基因表达的研究奠定基础。     

小桐子磷脂二酰甘油酰基转移酶(JcPDAT1) cDNA的克隆与功能鉴定

使用兼并PCR结合RACE技术从能源植物小桐子种子中克隆了一个PDAT基因的cDNA全长,命名为JcPDAT1 (GenBank登陆号为HQ827796)。JcPDAT1全长2 869bp,包含一个长为2 013bp的开放阅读框,编码670个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物PDAT高度同源,具有典型的PDAT结构域。Realtime PCR结果表明JcPDAT1在种子、叶和根里面都有表达,且在种子发育过程中大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有PDAT酶活性。在与酿酒酵母突变体H1246?的互补实验中发现, TLC层析（薄层层析法）和尼罗红染色结果都显示JcPDAT1的表达使H1246?恢复合成TAG,说明JcPDAT1具有PDAT的功能活性。       

花生种皮抗黄曲霉相关基因PnLOX2的表达分析

以高抗黄曲霉品种J11和高感品种金花1012黄曲霉处理的三个不同时期为材料,利用荧光定量PCR对种皮PnLOX2基因进行相对定量.结果表明:Real time PCR作为一种简单有效的定量方法,可快速检测待测基因的表达量差异;高抗黄曲霉品种J11在黄曲霉侵染过程中PnLOX2基因表达量变化显著,而金花1012的表达量变化较小,表明PnLOX2基因在花生种皮中存在并且可能与抗黄曲霉相关.     

实时荧光定量PCR筛选稻曲病菌内参基因

 通过实时定量PCR分析了稻曲病菌中5个传统内参基因18S rRNA、GAPDH、ubiquitin、β actin、α tubulin的mRNA差异表达情况,并利用geNorm软件分析了它们在4个发育时期和NaCl胁迫处理中的表达稳定性。结果表明,在菌龄为7 d、8 d、9 d、10 d的稻曲病菌中,α tubulin 2和β actin表达稳定;在0.4 mol/L  NaCl溶液处理0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后,β actin和α tubulin 2表达稳定。因此,当利用荧光定量PCR分析比较稻曲病菌基因表达差异时,可选择α tubulin和β actin作为内参基因。     

甘蓝型油菜转录因子FUS3的克隆、表达分析及其与脂肪酸组分的关系

 为了探讨油菜转录因子FUS3的功能及其与脂肪酸组分的关系，从甘蓝型油菜湘油15中克隆到BnaFUS3基因的两个拷贝BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3。它们的CDS区序列分别长927bp和948bp，编码309和315个氨基酸，氨基酸序列变异多发生在C端。转录因子BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3属于含B3结构域的蛋白家族，是亲水性蛋白，无跨膜区，均是膜外蛋白。系统进化树分析表明，BnaA2.FUS3、BnaA6.FUS3两者都是BraFUS3和AtFUS3的同源基因。荧光定量PCR分析表明，BnaA2.FUS3在根、茎、叶、角果皮中均有表达，在种子中相对稳定表达，但在角果皮25d达到峰值；BnaA6.FUS3为种子特异表达，在种子35d达到峰值；两者在角果皮中表达量均呈“M”形趋势。分析脂肪酸积累规律与BnaFUS3表达关系发现，授粉30d后，BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3表达迅速升高，此时各脂肪酸也进入快速增长期；授粉后45d~50d时，两拷贝表达量变化较小，脂肪酸积累亦进入缓慢增长期，并趋于平稳。表明BnaFUS3在甘蓝型油菜的胚胎形成和发育中具有重要影响，对脂肪酸的合成和油脂积累起到重要作用。     

蓖麻SnRK2基因家族的鉴定和特征分析

SnRK2是一类植物特有的Ser/Thr类蛋白激酶。为研究其在蓖麻抗逆过程中的作用,基于蓖麻的基因组序列信息,利用生物信息学方法鉴定了6个蓖麻SnRK2蛋白激酶成员。分析发现这些蛋白具有亲水性属性,基因结构分析表明,植物SnRK2基因在进化过程中具有很高的保守性;系统与进化分析发现植物SnRK2蛋白在单、双子叶植物中分化显著,可能是独立演化的结果。高通量RNA-seq测序结果显示,大部分SnRK2基因在检测的各个组织中均有表达,且在不同组织间或种子发育的不同阶段没有明显的组织特异性;外源ABA处理种子后,Group 2的基因表达显著上调。进一步利用半定量RT-PCR技术检测外源(100μmol/L)ABA、(250mmol/L)Na Cl和(4℃)冷胁迫处理的幼苗,发现Group 2中的基因29908.m006067被这3种胁迫强烈激活,基因29772.m000313对ABA和冷胁迫有较强的响应。     

大豆酰基载体蛋白硫酯酶基因及其启动子表达方式的初步分析

利用实时定量PCR方法,检测大豆酰基载体蛋白硫酯酶(acyl-ACP thioesterase)基因在大豆各组织中的表达方式,结果显示该基因在大豆根、茎、叶、花中的表达活性低,而种子中的表达活性较高。利用PCR方法,克隆大豆acyl-ACP thioesterase基因5’端上游2 057 bp序列,命名为AP。在线启动子预测软件分析结果表明AP序列中含有多种典型的种子特异表达元件,如RY repeat、SEF1 motif、SEF3 motif、SEF4 motif、E-box、ACGT等顺式作用元件,推测大豆acyl-ACP thioesterase基因启动子具有种子特异表达活性。     

花生油质蛋白基因的克隆与表达分析

油质蛋白作为贮藏蛋白的一种,特异性表达在油料种子中。本研究从花生中克隆得到3个Oleosin22基因,分别命名为AhOleosin22a,AhOleosin22b,AhOleosin22c。AhOleosin22a基因全长为630bp,编码210个氨基酸;AhOleosin22b基因全长为636bp,编码212个氨基酸;AhOleosin22c基因全长为582bp,编码194个氨基酸,均属于Oleosin蛋白质家族。通过荧光定量PCR对Oleosin22基因在花生中的表达模式进行分析。结果显示,AhOleosin22基因在种子中的表达量最高。本研究为阐明Oleosin22基因在花生油脂合成的生理生化机制中的功能奠定了理论基础,丰富了花生品质改良育种的基因资源。     

普通小麦TaADF8基因的克隆及表达分析

肌动蛋白解聚合因子(actin-depolymerizing factor,ADF)普遍存在于真核细胞中,为低分子量的肌动蛋白结合蛋白,在调控细胞内肌动蛋白纤维的聚合和解聚中起关键作用。为给深入研究TaADF8基因在小麦中的功能机理奠定基础,并为进一步丰富小麦ADF基因研究内容提供理论参考,本研究利用电子克隆策略从小麦品种CP53中克隆出TaADF8基因(GenBank登录号为KJ864962)后对其进行序列分析,并进一步采用荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对其在小麦不同组织间的表达差异及不同非生物胁迫下的表达模式进行分析。核酸序列分析表明,该基因全长695bp,拥有完整的ORF,编码142个氨基酸。氨基酸序列分析表明,该蛋白含有保守的ADF同源区和PIP2结合结构域,且在氨基端有核定位信号。进化和聚类分析表明,小麦TaADF8基因与大麦HvADF2基因、HvADF3基因和水稻OsADF3基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为75.35%、93.66%和67.86%。qRT-PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶、颖壳和雄蕊中均表达,且在根、叶和雄蕊中表达量较高;该基因表达受低温的强烈诱导,同时也受水分、高盐和外源脱落酸胁迫诱导。     

子房注射法转化‘紫宝石’蝴蝶兰的研究

采用子房注射法对‘紫宝石’蝴蝶兰进行外源DNA导入研究,结果表明:不同时期注射和不同注射处理方式对‘紫宝石’蝴蝶兰的落果率影响不同,对胚座组织和种子的GUS染色率的影响也不同,在授粉后65 d时,以2%DMSO为缓冲液,注射400μg/mL浓度质粒,种子的GUS染色率最高达6.14%。选取各注射时期无菌播种后获得的1 000个原球茎,经系列浓度的潮霉素筛选,结果发现授粉后65 d注射时获得的抗性植株最多,为31株,转化率为3.1%。切取转化植株幼叶及幼根进行GUS检测,均为阳性;随机挑选7株幼苗进行PCR检测,均能扩增出GUS基因和HPT基因条带,说明外源基因已经整合到植株的基因组内。此研究为兰科植物育种提供了一种简单高效的途径。      

花生脂质转运蛋白家族基因的克隆与表达分析

植物脂质转运蛋白（Lipid transfer protein,LTP）作为一类小分子碱性蛋白在脂类物质的运输、生殖发育,抵御不良环境等方面具有重要的作用,此外,LTP还作为一种过敏原存在。通过构建花生未成熟种子全长cDNA文库,克隆到了5类LTP基因,按照编码蛋白分子量的大小命名为AhLTP-11.5,AhLTP-12.8,AhLTP-11.8,AhLTP-8.3和AhLTP-19.2。生物信息学预测表明AhLTP-11.5属于AAI_LTSS蛋白家族的nsLTP1亚族,AhLTP-11.5编码蛋白的N端有26个氨基酸残基的信号肽序列,ProtCompv8.0预测结果显示该蛋白为分泌蛋白,胞外定位。从系统发育树中可以看出,花生的AhLTP-11.5和拟南芥的AthLTP亲缘关系较近。半定量RT-PCR结果表明AhLTP-11.5基因在花生茎、叶、花和种子中均有表达,在根中几乎检测不到 在花生种子的不同发育时期AhLTP-11.5基因在DAP15d时表达量较低,20d以后表达趋于稳定。     

增塑剂对小麦种子萌发过程中细胞程序性死亡指标的影响

为了明确增塑剂与细胞程序性死亡(PCD)的关系,用邻苯二甲酸酯类增塑剂处理小麦种子,研究增塑剂对小麦种子萌发过程中细胞程序性死亡相关指标的影响,并对增塑剂诱导细胞程序性死亡的生理生化和分子机制进行了初步探讨.结果表明,增塑剂对小麦种子萌发率有显著影响,能够抑制小麦种子萌发.增塑剂处理后小麦种子萌发过程中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性先上升后下降,同时实验后期抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性也有类似的趋势.经DNA ladder实验证明,高浓度增塑剂处理能够引发小麦种子细胞程序性死亡.其原因可能与增塑剂促进gr、dhar以及vpe、metacaspase基因的表达有关,且随着增塑剂浓度的不断增大,各基因相对表达量变化趋势基本一致.     

TaMBD2基因cDNA全长克隆及其在小麦叶片和种子中的表达

为探讨甲基结合蛋白(MBD)在小麦生长发育过程中的生物学功能,通过RACE技术克隆了小麦TaMBD2基因的cDNA全长,并分析了该基因在小麦叶片、种子发育及萌发过程中的表达特性。RACE克隆及序列分析表明,TaMBD2基因cDNA全长为1 511 bp,其中5 UTR 164 bp,3 UTR 405 bp,ORF 942 bp。对该基因编码氨基酸序列的分析发现,TaMBD2编码蛋白中包含有1个典型的甲基结合域和1个CW型锌指结构域;通过RT-PCR分析发现,TaMBD2基因在叶片中的表达随着小麦的生长发育而逐渐增强;在种子发育过程中,该基因在花后20和30 d时的表达量最高;在种子萌发过程的胚和胚乳中,该基因的表达水平变化不大。     

大豆PAL2-3基因的克隆及转化研究

大豆异黄酮是苯丙氨酸代谢途径中合成的一类次级代谢产物,在苯丙氨酸代谢途径中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验首先通过克隆大豆中PAL2-3基因;然后构建pCAMBIA3301-GmPAL2-3植物过表达载体,将构建好的pCAMBIA3301-GmPAL2-3表达载体重组质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节转化体系获得转化植株,并对T1代转化植株进行PPT检测,外源标记基因Bar检测以及荧光定量PCR检测,对转基因阳性植株进行大豆籽粒异黄酮含量的测定。结果表明T_1代转基因植株中PAL2-3基因的表达量是对照的5.11~11.24倍,总异黄酮含量最高的(2 587.63μg·g~(-1))是对照(1 616.90μg·g~(-1))的1.6倍。因此在大豆中过量表达PAL2-3基因可以提高大豆籽粒中异黄酮含量。     

实时PCR定量分析干旱胁迫下水稻糖原合成酶激酶基因表达差异

通过实时荧光定量PCR进行相对定量分析,得到水稻IR64糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase, GSK）基因在不同生育期、不同组织干旱胁迫处理前后的表达差异。 叶片中GSK基因为组成型表达,各生育期干旱胁迫时诱导合成增加,尤其从分蘖期到抽穗期表达更为显著,说明这段生长期叶片对水分缺乏最敏感;苗期根系处理后GSK表达明显下降,叶片处理前后GSK表达无明显变化。由此可见,GSK基因的表达在不同的发育时期、不同的组织中呈现差异。     

小麦醇溶 谷蛋白盒结合因子基因表达特性的研究

为了给小麦品质改良的基因工程研究提供参考依据,以小麦醇溶-谷蛋白盒结合因子(Wheat Prolamin-Box Binding Factor, WPBF)基因为研究对象,从定性和定量两个方面,利用RT-PCR与Real Time PCR系统地研究了WPBF基因在小麦不同组织器官中以及在小麦胚乳整个发育过程中表达的时空特异性.结果表明,WPBF基因的表达是胚乳特异性的,表达跨胚乳的整个发育过程,在其表达的高峰阶段,表达强度为参照基因β-Actin的43%.     

茄子冷诱导转录因子CBF的分离及分析

利用白菜CBF基因序列搜索茄子基因组DNA序列和茄子EST序列,然后参考这些序列设计开放型阅读框两端的特异引物,以茄子叶片cDNA为模板克隆获得了该基因的cDNA序列。经生物信息学分析证实该序列是CBF基因,命名为SmCBF（登录号：KY780486.1）。该基因编码211个氨基酸,包含AP2功能域和DNA结合位点,属于AP2超基因家族。用PlantCARE分析SmCBF基因启动子序列的顺式作用元件,发现了1个MYC识别位点和1个MYB结合位点,说明该基因受到MYC和MYB的调控。采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低温诱导茄子中的表达情况,结果显示该基因随着低温处理时间延长表达量逐渐升高,在6 h达到最高值,说明低温诱导该基因表达。