马尾松体细胞胚胎发生相关基因PmSERK1的克隆与表达分析

体细胞胚胎发生不仅是植物微繁、种质保存的有效手段,同时也是研究高等植物胚胎发育和遗传转化的模式系统之一。本研究从马尾松未成熟合子胚诱导的胚性细胞团中成功克隆了体胚发生受体激酶基因PmSERK1。该基因全长2303bp,包含完整的开放阅读框,编码626个氨基酸,其蛋白分子量约为69kD。序列分析发现PmSERK1与其它植物的SERK基因高度同源。系统进化树重建表明,PmSERK1与已知参与体胚发生的关键SERK基因聚为一类,如MtSERK1、CuSERK1、AtSERK1和DcSERK。表达分析显示:PmSERK1在主要的组织器官(根、茎、针叶等)略有表达;但在诱导培养的非胚性愈伤中没有检测到表达,而在经继代培养的胚性愈伤中表达很高且逐渐增加,且在培养20d时达到最高。另外,在再生的子叶胚中,PmSERK1的表达量也很高。综上所述表明,PmSERK1是与体胚发生相关的关键SERK基因的直系同源基因,可以作为愈伤组织胚性的标记基因。     

马尾松PmMADS13基因的克隆与表达分析

SOC1/TM3是MADS-box家族一员,它能介导多条开花途径的信号整合,从而调控开花的时间和花器官的发育。为了解SOC1类基因在马尾松生殖生长中的作用,从转录组测序结果中筛选到一条SOC1类同源基因,设计特异性引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得该基因的全长cDNA序列为1 147 bp,包括666 bp的开放阅读框(ORF),共编码220个氨基酸,命名为PmMADS13。氨基酸序列比对分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端具有高度保守的SOC1 motif基序;进化树分析表明马尾松PmMADS13与油松的DAL9基因、辐射松的MADS9基因、火炬松的MADS13基因的亲缘关系最近,属于SOC1/TM3亚家族;RT-PCR分析显示,PmMADS13在马尾松生殖器官雌花、雄花中均有高表达,其次是茎端和针叶,在根部组织中的表达量最低。推测PmMADS13是参与马尾松成花的重要基因。     

马尾松PmCOMT基因的克隆及实时定量表达分析

在木质素生物合成里,咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)起重要作用。本论文以马尾松幼苗作为材料,并通过PCR技术以及RACE技术从马尾松材料中克隆出Pm COMT基因的cDNA全长。该cDNA全长为1660bp,其中预测完整ORF全长为1125bp,可编码374个氨基酸的蛋白。蛋白相对分子质量为41.81 kD;等电点(pI)为5.03,总平均亲水性为-0.311。通过生物信息学的方法对其进行分析表明,Pm COMT基因具有典型的甲基转移酶的保守结构域。通过实时荧光定量表达分析表明,COMT基因在马尾松的不同组织均有表达,其中在新梢中的表达量最高,树皮中表达量最低。     

高等植物体细胞胚胎发生的研究进展

植物体细胞胚胎发生是一个复杂的发育过程,受到多种内、外因素的影响与调节,研究体细胞胚胎发生诱导与调节是一个基本的理论问题。通过介绍高等植物体细胞胚胎发生过程中生长素对胚胎发育的影响以及体胚发生中的基因表达,展示体胚发生已经成为研究植物胚胎发生发育的一条重要途径。同时体胚发生中分离到的基因研究为理解细胞分化与发育,形态发生与建成以及植物合子胚的发育提供了重要参考。     

洪平杏体细胞胚胎发生初探

以洪平杏(Armeniaca hongpingensis Yu et Li)不同取样时期的不同外植体进行愈伤组织的诱导,研究发现洪平杏开花11周左右的去子叶胚和子叶较容易诱导出愈伤组织,污染率低,诱导率高。不同外植体愈伤组织诱导能力大小依次为去子叶胚=子叶>未成熟胚>花药>嫩叶叶柄>嫩叶叶片。以洪平杏子叶为外植体诱导体细胞胚胎发生,诱导子叶愈伤组织的最佳培养基是MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA,愈伤诱导率为(97.04±2.31)%;胚性愈伤组织诱导的培养基为MS+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA;体细胞胚胎增殖的培养基为MS+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.2 g/L水解酪蛋白。     

马尾松幼苗PmMADS4基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因编码的转录因子,在植物、动物及微生物的发育过程中起着重要调控作用,本研究从马尾松幼苗转录组测序结果中筛选到1条具有完整开放阅读框的MADS-box基因序列,设计特异性引物并克隆获得该基因,通过生物信息学方法分析该基因的序列特征、编码蛋白的理化特性、结构域以及进化关系等,并应用荧光定量PCR技术分析该基因在马尾松幼苗不同组织中的表达活性。结果表明,克隆得到的MADS-box基因开放阅读框为672 bp,命名为Pm MADS4。Pm MADS4编码223个氨基酸,含有MADS保守域和K-box次级保守域。蛋白质理论分子量为24854.15 kD,理论等电点为7.83;其蛋白质结构主要由大量的α-螺旋(58.74%)和大量随机卷曲(31.84%)构成;亚细胞预测该基因主要在细胞核(43.5%)、线粒体(17.4%)、高尔基体(13.0%)和细胞质(13.0%)中发挥生物学作用。系统进化分析显示,Pm MADS4属于MADS-box家族基因中MIKC型的GMADS分支。组织特异性表达分析发现,Pm MADS4在马尾松幼苗的顶芽和茎中高表达,表达量分别是根部的239倍和123倍;在根部、初生叶和针叶中的表达量相对较低,表明Pm MADS4可能广泛参与马尾松幼苗地上部分分生组织的发育过程。本研究结果为Pm MADS4基因在马尾松幼苗生长发育调控方面的深入研究提供了数据基础。     

欧洲七叶树体细胞胚胎发生研究

以欧洲七叶树幼嫩叶片为外植体,在离体条件下成功诱导出体细胞胚胎(体胚).研究结果表明,诱导愈伤组织的适宜培养基是MS 2,4-D 2mg/L KT 0.2mg/L,MS BA 8mg/L NAA 1mg/L有利于胚性愈伤的诱导和增殖,添加ZT 2mg/L或BA 5mg/L和NAA 0.2mg/L 的MS培养基有利于体胚发育和成熟.     

马尾松RCA基因的克隆和序列分析

1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubis CO)活化酶(RCA)是体内活化光合作用限速酶—Rubis CO的重要酶。本研究通过反转录PCR和c DNA末端快速扩增技术,从马尾松中分离得到了Pmrca1(登录号KF420118)和Pmrca2(登录号KF420119)两条RCA基因c DNA序列。两条序列均包含完整的编码区与5'端和3'非翻译区,长度分别为1 816 bp和1 953 bp,编码Pm RCA1和Pm RCA2两个蛋白,长度分别为480和440个氨基酸。序列分析发现两个蛋白质都具有RCA和AAA+蛋白家族(ATPase associated with various cellular activities)特异性结构域和定位于叶绿体的转运肽,Pm RCA1还具有RCA大同工型特有的由两个半胱氨酸(Cys)残基组成的保守结构。多重序列比对显示,这两个蛋白质序列分别与红花槭的RCA大同工型和小同工型的相似性达到78%。将Pm RCA1和Pm RCA2与20种不同物种RCA构建进化树,发现其与地中海松属于同一分支。研究结果为进一步分析马尾松RCA的功能和光合作用机制奠定了基础。     

2,4-D、KT对棉花愈伤组织的诱导和体细胞胚胎发生的影响

诱导棉花下胚轴切段形成愈伤组织需要外源2,4-D,加入激动素(KT)可以增进2,4-D的效果.愈伤组织形成胚性细胞和胚性细胞团的过程需要2,4-D和KT的共同作用.KT可以促进胚性细胞团分化出胚状体,加入2,4-D则会降低KT的效果.采用2,4-D(0.05mg/L)+KT(0.1mg/L)诱导愈伤组织,60天后转移到无激素的液体培养基上振荡培养,得到了大量的胚状体.     

马尾松纤维素合成酶基因PmCesA1的克隆及其分析

植物纤维素合成酶(Ces A)是林木中纤维素合成过程中的重要酶,与木材形成密切相关。本研究以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的c DNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松Ces A1基因的全长c DNA序列,命名为Pm Ces A1。序列长度为3 142 bp,包含有一个长为2 955 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码984个氨基酸。序列分析表明:Pm Ces A1序列与已报道的火炬松(Pinus taeda)Ces A1基因(AY789650.1)的相似性达99%。对Pm Ces A1所编码蛋白的氨基酸序列聚类分析,结果显示马尾松与松科植物具有较近的亲缘关系。采用实时定量PCR测定了Pm Ces A1在马尾松的嫩枝、叶和根中的表达量,发现以嫩枝中的表达量最高(2.53)。本研究获得的全长基因可以用来构建正义表达载体,再通过遗传转化得到转基因植株,可进一步分析该基因在植株内的表达情况和作用机制,为马尾松纤维素合酶的研究和获得高纤维得率的马尾松良种提供帮助。     

长江和黄河流域棉区棉花品种体细胞胚胎发生和植株再生比较研究

选用我国长江和黄河流域棉区各10个棉花品种以及珂字201和YZ1共22个基因型,研究和优化棉花体细胞胚胎发生的相关条件参数。在此基础上,比较了两生态区棉花品种的体细胞再生能力。结果表明, 在IBA+KT的激素组合下,多数基因型有较强再生能力;在愈伤组织诱导时期,铵态氮是必需的,而在愈伤组织继代分化时期,一定浓度的硝态氮则能促进分化;没有铁盐不能诱导出愈伤组织,而铁盐浓度为56 mg L^-1时有利于胚分化;长江流域和黄河流域棉花品种的植株再生潜力没有明显差别,但长江流域的品种体细胞胚胎发生所需的时间长。本文首次获得了鄂抗棉3号、5号、鄂棉20、鄂棉23、豫棉9号、豫早73、豫棉12、豫棉1221等8个品种的体细胞胚胎发生和植株再生。     

甘薯体细胞胚的发生和植株再生

利用含不同浓度2,4-D的修改的MS培养基对7个甘薯(Ipomoea batatas Lam.)品种进行茎尖脱毒培养,产生了形态和解剖特征明显不同的3种愈伤组织,胚性愈伤组织的诱导频率与品种和2,4-D浓度有关。将胚性愈伤组织转移到不含激素的修改的MS培养基上,有3个品种的胚性愈伤组织进一步发育成鱼雷胚和子叶胚。其中高淀粉品种苏薯2号的子叶     

不同种源马尾松幼苗对低磷胁迫的生理响应

对四川眉山(SM)、贵州孟关(GM)、广西桐棉(GT)、福建龙岩(FL)、福建武平(FW)、江西崇义(JC)及湖南汝城(HR)等7个种源的马尾松幼苗在轻度、中度和重度低磷胁迫下生理生化响应进行了研究.结果表明,在低磷胁迫下,不同种源马尾松幼苗叶绿素(a+b)含量呈下降趋势,其中FW下降幅度最大(65.0％),FL降幅最小(20.5％),而类胡萝卜素含量在低磷胁迫下变化较小;随低磷胁迫程度的增加,整体上马尾松幼苗可溶性糖含量逐渐增加,可溶性蛋白含量逐渐减少,游离脯氨酸含量则变化较复杂.其中,在重度低磷胁迫下,GT可溶性糖含量增加最大,较对照增加了38.9％,GM种源可溶性蛋白含量降幅最大,降低了49.5％,FW种源脯氨酸含量增加最大,为对照处理的3.5倍;MDA含量、POD、SOD及CAT活性等均在低磷胁迫下呈上升趋势,其中,SM种质在不同低磷胁迫间MDA含量无显著差异.除GT、JC及HR外,其余种源马尾松在轻度和中度低磷胁迫下根系活力上升.以上结果表明,马尾松通过降低叶绿素和可溶性蛋白含量以及根系活力,增加MDA、可溶性糖和游离脯氨酸含量,提高POD、SOD、CAT活性来应对低磷胁迫.     

甜樱桃体细胞胚胎发生及植株再生的研究

以甜樱桃红灯为材料,幼果用0.1%HgCl2进行消毒,在无菌条件下取出未成熟胚子叶进行诱导,在胚成苗后进行继代和生根培养。培养结果表明,以MS为基本培养基,在2,4-D为2.0 mg/L时培养基上胚性愈伤组织诱导率较高,为53.7%;愈伤组织经过数次继代后转移至MS附加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L培养基上可诱导体细胞胚的形成,诱导率可达81.0%.体细胞胚在合适的培养基上可继续生长和增殖。     

甘薯体细胞胚状体及其在脱毒、扩繁中的应用

通过甘薯徐薯18茎尖体细胞培养诱导胚性愈伤组织和胚状体,建立了体细胞无性系.胚性愈伤和胚状体诱导培养基为MS附加0.5～2.0mg/L 2,4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L BA及100mg/L HL.研究结果表明:采用茎尖体细胞胚胎发生途径能够同时实现试管苗的深度脱毒及大幅度提高扩繁量,脱病毒率达95%,扩繁量达382.9倍.田间种植该脱病毒种苗能     

茶树愈伤组织继代培养与体细胞胚发生

利用添加不同种类,浓度的１／２ＭＳ修改培养基、Ｂ５培养基交叉培养茶树（ＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓＬ．）愈伤组织,有利于延长愈伤组织继代培养时间,并维持胚性愈伤组织高的体细胞胚分化能力,不同品种的胚性愈伤组织体细胞胚分化率存在明显差异,试管苗茎胚性愈伤组织分化率高于大田栽培的成龄茶树叶柄胚性愈伤组织。胚性愈伤组织随着继代培养时间的延长,体细胞胚分化率随之有所下降,胚性愈伤组织在继代培养过程中,     

棉属G染色体组野生棉种的体细胞胚胎发生与植株再生研究

通过培养基激素配比、碳源种类等培养条件的筛选，对2个G染色体组棉种（纳尔逊氏棉，Gossypium nelsonii Fryx.；澳洲棉，Gossypium australe F. Muell.）进行体细胞培养并获得了体细胞胚，其中纳尔逊氏棉获得了再生植株，澳洲棉获得了大量的胚状体。与D染色体组棉种克劳茨基棉（Gossypium klotzschianum Anderss）相比，G染色体组棉种再生时间长，且体细胞胚畸形严重、萌发困难，但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。激素组合0.1 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 2, 4-D诱导的愈伤组织较松软，分化潜力高；胚性愈伤组织的增殖使用0.2 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 IBA的激素组合；组合0.25 mg L^-1 IBA＋0.3 mg L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生，而含激素组合MSB5+0.15 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎的萌发和植株再生。此外，愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源，而在胚性愈伤组织的增殖及保存和胚状体的萌发过程中用麦芽糖作碳源的效果更佳。     

诱导不同基因型大豆未成熟子叶体细胞胚胎发生的研究

以未成熟子叶为外植体,研究25种基因型对大豆愈伤组织形成与体细胞胚胎发生的影响。结果表明,大豆不同基因型间愈伤组织诱导率变化较小,而基因型对体细胞胚胎发生的影响较大,依基因型不同体细胞胚诱导率变化在3.33%～83.33%。体细胞胚诱导率、平均胚数在基因型间的差异均达极显著水平,且两者间存在极显著相关关系。     

低酚陆地棉直接体细胞胚胎发生和植株再生

选用低酚陆地棉无菌苗下胚轴为材料进行全固体组织培养,直接诱导获得了胚性愈伤组织,并进一步分化为再生植株.结果表明,激素是影响棉花直接体细胞胚胎发生的重要因素.MSB培养基中添加2,4-D有利于愈伤组织的形成,却不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基中添加IBA和BA也不能直接诱导获得胚性愈伤组织.MSB培养基附加适当浓度的IBA和KT能直接诱导出胚性愈伤组织.最适激素组合(1.0 mg/L IBA,0.5 mg/L KT)能使诱导棉花下胚轴产生大量胚性愈伤组织,并且在3个月内就可肉眼观察到不同发育时期的胚.MSB培养基中附加1.0 g/L谷氨酰胺和0.5 g/L天门冬酰胺有利于胚萌发成苗.本研究建立了简便高效的棉花直接体细胞胚胎发生和植株再生培养体系,从胚性愈伤组织诱导到植株再生约需5～6个月时间.     

荔枝胚性悬浮细胞系的快速建立及其体胚植株的再生

荔枝幼胚诱导的胚性培养物在低糖条件下连续继代4~6次左右,可筛选到颗粒细小、不含原胚的松散型胚性愈伤组织;以这种松散的胚性愈伤组织作为起始材料,在附加2,4-D 2mg/L或2,4-D 2mg/L、KT1 mg/L、AgNO3 5mg/L的MS液体启动培养基上振荡培养（100~120 r/min）10~14 d,即可建立起分散性良好的胚性悬浮细胞系。采用激素减半的2种启动培养基交替继代培养或周期性固体－液体轮回培养,可以长期保持胚性悬浮细胞系。荔枝胚性悬浮细胞在附加NAA 0.1 mg/L、KT 或Ze 5 mg/L、肌醇100 mg/L、蔗糖50g/L、琼脂10g/L的MS固体培养基上诱导体胚,25~40d后可形成大量胚状体,诱导体胚数量达10,000个/g FW以上。经过成熟培养后,正常的体胚75%以上萌发再生完整植株。