梅山猪前体脂肪细胞的分离培养及分化相关基因的表达规律研究

本试验旨在建立梅山猪前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索梅山猪脂肪组织增生的生物学特征。采集3日龄梅山猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶分离前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,并对其进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色鉴定及脂肪含量的测定,且采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、CEBPα、LPL、DLK1、FABP4及ADIPOQ mRNA在梅山猪前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果表明:分离的梅山猪原代前体脂肪细胞约6 h开始贴壁,贴壁的细胞呈小梭形或不规则的三角形,经传代后成分均一,贴壁良好,呈成纤维细胞样形态,第1~9天细胞进入指数生长期,细胞生长曲线近似S形;诱导培养第11天细胞充脂率高,油红O染色呈红色,细胞内脂肪含量显著高于未诱导组,具有前体脂肪细胞的典型特征;PPARγ在猪前体脂肪细胞分化早期就有表达,分化第3天高度表达,CEBPα和LPL随着分化过程表达量逐渐增加,而DLK1表达量逐渐下降,FABP4和ADIPOQ在第6天高度表达。综上,本研究成功建立了梅山猪前脂肪细胞的培养方法和诱导分化方法,为进一步研究梅山猪体脂沉积和改善肉品质奠定基础。     

猪甘油三酯水解酶和激素敏感脂酶基因表达规律的研究

利用半定量RT-PCR法分析比较了甘油三酯水解酶(Triacylglycerol hydrolase,TGH)和激素敏感脂酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)基因在不同猪种、不同发育阶段及不同部位脂肪组织中转录表达的差异,探讨其在猪脂肪组织的表达规律。结果显示,脂肪型个体TGHmRNA表达丰度显著低于瘦肉型和杂交型个体,成年猪较初生仔猪低,皮下、腹膜和内脏脂肪组织中TGH表达量依次递增;其变化规律与HSL相同。此外,对分离培养的原代前体脂肪细胞通过诱导分化和油红O染色区分分化状态,分析TGHmRNA表达的时序变化,发现TGH在前脂肪细胞中不转录表达,诱导分化后开始表达,且在诱导分化第4天表达量最高,分化第10天表达量下降,达到峰值的时间较HSL早。结果表明,TGH的表达与个体肥胖程度、年龄、脂肪组织部位以及脂肪细胞分化程度相关,同时,在脂肪细胞分化过程中,TGH表达峰值早于HSL,提示TGH在脂肪细胞发育过程中可能较早承担基础脂解作用。     

莱芜猪前体脂肪细胞的原代培养及诱导分化研究

为了建立莱芜猪前体脂肪细胞的体外培养体系,探索猪脂肪组织增生的生物学特征。本研究采集1日龄莱芜猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用胶原酶与胰蛋白酶相结合的方法,分离原代前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,以及前体脂肪细胞诱导分化的研究,并采用Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ的表达。结果表明,分离的猪原代前体脂肪细胞约8h后开始贴壁,贴壁的细胞呈短梭形或不规则的三角形,第3天多数细胞进入指数生长期,呈成纤维细胞样形态,细胞生长曲线近似S形;诱导培养结果显示,少量细胞在第2天开始出现脂滴,大多数细胞在第3天出现脂滴,第7～8天小脂滴逐渐融合成大脂滴,在第12天左右融合成大脂滴,油红O染色呈橘红色。在前体脂肪细胞分化过程中PPARγ基因mRNA的表达量逐渐增加,在诱导后的48h表达量最高,随后其表达丰度逐渐下降。本试验成功建立了莱芜猪前体脂肪细胞培养体系和体外诱导分化模型,为进一步研究莱芜猪前体脂肪细胞增殖与分化机制和猪体脂肪的沉积奠定基础。     

共轭亚油酸对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化的影响

实验采用酶消化原代培养脂肪细胞的方法培养大鼠前体脂肪细胞。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线的绘制、计算细胞倍增时间、油红O染色、ELISA等一系列方法,观察共轭亚油酸(CLA)对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化,以及瘦素、脂联素分泌功能的影响。结果表明:CLA对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化有显著抑制作用,而对其瘦素、脂联素的分泌没有显著影响。     

不同浓度的葡萄糖对大鼠脂肪细胞增殖分化的研究

研究葡萄糖在脂肪细胞的增值与分化过程中对其细胞形态、增殖分化的规律。用消化法培养大鼠脂肪细胞,以MTT法检测增殖程度。实验证明,葡萄糖对大鼠脂肪细胞增殖有促进作用,葡萄糖的浓度为20 mm L/L时细胞增殖分化的作用最大(P0.05),到25 mmo L/L时葡萄糖对原代大鼠脂肪细胞的增殖分化的能力减少,可能是由"高糖毒性"造成。     

家畜原代前体脂肪细胞离体培养模式研究

本文阐明了家畜原代前体脂肪细胞离体培养模式及其特点、家畜原代前体脂肪细胞有血清培养模式与无血清培养模式、家畜原代前体脂肪细胞离体培养模式中激素、生长因子和细胞因子调控脂肪细胞分化的作用及脂肪细胞离体培养的分化过程以及脂肪细胞分化的鉴定。     

民猪脂肪细胞分化过程中抗寒相关基因表达规律研究

旨在探究民猪脂肪细胞分化过程中产热基因和米色脂肪标记基因的表达变化规律，为进一步研究民猪脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制提供依据。本研究采集1月龄民猪的背部脂肪组织，分离前体脂肪细胞进行培养及成脂诱导，观察分化过程中细胞形态并进行油红O染色鉴定；检测产热基因UCP3、PGC-1α、PPARα和米色脂肪标记基因EBF2、CD81、PDGFRα在诱导分化第0、2、4、6、8天的表达量。结果表明，随着诱导分化的时间增加，细胞中的脂滴逐渐增多，在分化第8天时进行油红O染色，多数细胞达到成熟脂肪细胞阶段。以第0天为对照，PGC-1α、EBF2、PDGFRα在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且达到最高，第4、6、8天呈下降趋势。UCP3在第4、6、8天表达量极显著升高（P<0.01），第8天有所下降。PPARα和CD81在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且在第4和6天表达量与第2天相比变化不大。综上表明，本研究成功进行了民猪前体脂肪细胞的成脂诱导分化，揭示了分化过程中产热和米色脂肪标记基因的表达规律，为进一步研究民猪前体脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制和民猪抗寒能力奠定基础。     

猪DFAT细胞成脂再分化过程中KLF2和PPARγ的表达

旨在探讨猪去分化脂肪细胞(DFAT)再分化过程中Krüppel样因子2(KLF2)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达模式,为揭示猪DFAT细胞再分化机制奠定基础。采集猪成熟脂肪细胞,经"天花板"培养法获得DFAT细胞,用流式细胞仪检测表面抗原,形态学和油红O染色提取法检测成脂分化程度,Real-time PCR检测KLF2和PPARγmRNA的表达。结果表明,猪成熟脂肪细胞接种第3天,可见明显的去分化迹象,即细胞形成犄角状突起,大脂滴分解成小脂滴并向细胞外排出脂滴,接种至第9天脂滴基本排出完毕,接种至第12天原代细胞长满底壁;间充质干细胞表面抗原CD29、CD44和CD105的阳性表达率分别达到99.0%、97.8%和99.5%,而造血干细胞表面抗原CD45和CD34的表达仅为3.55%和4.55%;将F3代细胞成脂诱导3d,胞质中出现脂滴,并随诱导时间增加,脂滴数量增多,体积增大,诱导至12d诱导率达80%以上;成脂诱导2、5、10和15d时,KLF2mRNA的相对表达量分别为0.47±0.02、0.35±0.07、0.31±0.09和0.11±0.07,PPARγmRNA的相对表达量分别为1.62±0.01、2.03±0.04、3.22±0.04和3.49±0.06。本研究成功获得高纯度的DFAT细胞,具有间充质干细胞特性和成脂再分化能力;KLF2 mRNA的表达在成脂分化过程中随诱导时间的增加而减少,而PPARγmRNA的表达量随诱导时间的延长逐步增加;表明KLF2在DFAT细胞的成脂再分化过程中可能发挥抑制作用,而PPARγ可能会发挥促进作用。     

绵羊前体脂肪细胞的原代培养及分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞的原代培养方法,探讨反刍动物脂肪沉积机理.以1日龄羔羊的肾周脂肪组织为试验材料,采用组织块法和酶消化法分离培养前体脂肪细胞,观察形态学变化,测定生长曲线,油红O染色检测细胞内脂肪含量,并用实时定量PCR法检测脂蛋白脂酶、过氧化物体增殖剂活化受体γ、脂肪酸合酶的表达量.结果表明:原代培养的细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前体脂肪细胞的形态特征和基因表达特性,为绵羊前体脂肪细胞.本试验成功建立了绵羊前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程.     

牛肌内前体脂肪细胞的分离培养及分化相关基因的表达规律研究

旨在建立肉牛肌内前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索肉牛肌内脂肪组织增殖和分化的生物学特征。采集成年牛背最长肌,分离肌内脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶分离获得前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,并对其进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色鉴定及脂质含量的测定,且采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、ADIPOQ、ATGL、HSL、LPL mRNA在牛肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果:分离的牛原代前体脂肪细胞约6 h开始贴壁,贴壁的细胞呈小梭形或不规则的三角形,经传代后成分均一,贴壁良好,呈成纤维细胞样形态,第5~11天细胞进入指数生长期,细胞生长曲线近似S形;诱导培养第8天细胞充脂率高,油红O染色呈红色,细胞内脂质含量显著高于未诱导组,具有前体脂肪细胞的典型特征;PPARγ、C/EBPα、FABP4、ADIPOQ和ATGL的表达量随着分化过程增强,HSL的表达量随着分化过程逐渐降低,而LPL的表达量在分化早期逐渐升高,分化后期逐渐下降。综上,本研究成功建立了牛肌内前体脂肪细胞的培养方法和诱导分化方法,揭示了分化关键基因在此过程中的表达规律,为进一步研究肉牛肌内脂肪沉积和改善肉品质奠定基础。     

Cellular and enzyme-histochemical aspects of adipose tissue development in obese (Ossabaw) and lean (crossbred) pig fetuses: an ontogeny study

The cellular and enzyme-histochemical differentiation of subcutaneous adipose tissue was studied in lean and obese pig fetuses at several ages. Positive reactions for a variety of cytosolic and organellar enzyme markers indicate metabolic competence of fetal adipocytes despite their small size (12 to 15 microns). Reactions for several enzymes decreased with fetal age and may be associated with a qualitative change in activity of adipocyte organelles. Age-associated increases in two lipogenic enzymes were observed in obese adipocytes. Observations on developing cells around hair follicles in the younger fetuses indicated significant temporal lags between the appearance of detectable enzyme activities in adipocytes. Enzyme activities in order of appearance were: dehydrogenases (cytosolic and mitochondrial), lipoprotein lipase and esterase. Esterase activity and several other enzymes were never observed in lipid positive cells that were not spherical. A proportion of hair follicle associated adipocytes in 110-d-old lean fetuses were histochemically and morphologically similar to brown adipocytes in the young rat. There was no evidence for brown adipocyte like cells in obese fetuses. Finally, comparison of the enzyme-histochemical differentiation of lean and obese fetal adipocytes indicates that fetal adipocytes become sensitive to external stimuli between 70 and 90 d of gestation.     

秦川牛ACTC1基因的表达特性分析

试验旨在揭示ACTC1基因在秦川牛中的时空表达规律，为进一步研究ACTC1基因在肉牛肌肉发育和脂肪沉积等方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR技术检测了ACTC1基因在24月龄成年秦川牛13种组织和4日龄新生秦川牛12种组织中的表达规律，同时研究分析了该基因在秦川牛成肌细胞和前体脂肪细胞不同分化阶段（0、2、4、6、8 d）的表达特性。结果显示，ACTC1基因在秦川牛心脏中的表达量最高，骨骼肌中次之；除瘤胃和肾脏外，24月龄成年牛各组织中的表达量显著或极显著高于4日龄新生牛（P<0.05；P<0.01）；ACTC1基因在成肌细胞中的表达随着分化程度的增加呈现先升高后降低的趋势，在成肌细胞分化第2、4、6和8天ACTC1基因的表达量与第0天相比差异极显著（P<0.01），分别是第0天的2.6、4.7、5.6和4.2倍，这与成肌细胞的分化速率一致；在脂肪细胞中ACTC1基因的表达趋势为先降后升，第2、4天的表达量与第0天相比差异极显著（P<0.01），从分化第2天开始表达量随脂肪细胞分化程度增加而增加。ACTC1基因在不同年龄牛肌肉组织（心肌和骨骼肌）中的表达量最高，且其表达特性与肌细胞分化整体趋势一致；另外，ACTC1基因在脂肪细胞中的表达也有一定的规律。综上所述，推测ACTC1基因可能会影响牛肌肉组织的生长发育和脂肪沉积。     

Cellularity of developing subcutaneous adipose tissue in Landrace and Meishan pigs: Adipocyte size differences between two breeds

Experiments were designed to compare the adipocyte cellularity of subcutaneous adipose tissue between growing Landrace (low backfat) and Meishan (high backfat) pigs at 1 week, 3 weeks, 6 weeks, 3 months and 5 months of age. As pigs aged, body weight and backfat thickness of both breeds significantly increased. When compared at equal ages, backfat thickness adjusted to equal body weight was greater for Meishan pigs. The mean diameter of fat cell size also increased with age, and by 6 weeks adipocytes from both outer and inner layers of subcutaneous adipose tissue were larger in Meishan pigs. At 5 months, approximately 80% of the adipose tissue mass in Meishan pigs was attributable to adipocytes measuring 95–165 µm in diameter, whereas adipocytes of 75–145 µm comprised most of the tissue mass in the Landrace. Although the contribution of smaller adipocytes (25–45 µm) to the tissue volume was negligible, both breeds showed a biphasic diameter distribution at all ages, suggesting that adipocyte hyperplasia is still active. Our results demonstrate that cellularity differences exist between the subcutaneous adipose tissues of Landrace and Meishan pigs, and adipocyte hypertrophy is the most overwhelming contributor to the greater backfat deposition for Meishan pigs.     

Pre-adipocyte proliferation and differentiation in response to hormone supplementation of decapitated fetal pig sera

Growth hormone and thyroid hormones have been implicated as important serum factors for adipocyte development in cell culture. Fetal decapitation removes these factors from serum of the growing fetal pig and results in development of fewer adipocytes than in intact fetuses. These experiments examined the effects of growth hormone or thyroxine supplementation to decapitated fetal pig sera upon pre-adipocyte proliferation and differentiation. Hormones were supplemented to concentrations present in sera from intact pig littermates (reference). Sera +/- hormones were analyzed for their effects upon pre-adipocyte proliferation as determined by [3H]-thymidine incorporation; enzyme expression as determined by sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity; and induction of complete differentiation into lipid filled adipocytes as based upon a pre-adipocyte proliferation and enzyme expression than reference sera. Growth hormone had no effect in decap sera upon these parameters. Decap sera permitted detection of 54% more lipid-accumulating, newly formed adipocytes on percol gradients than reference sera, but growth hormone reduced detection to 29% of reference sera. Thyroxine specifically stimulated pre-adipocyte proliferation more than decap sera, but not to the level of reference sera. Complete differentiation, a formation of lipid-accumulating adipocytes was promoted also by thyroxine in comparison to basal decap sera. The results of these experiments indicate thyroid hormones are an important component of fetal sera for regulation of adipocyte development, whereas growth hormone may only affect cellular metabolism and not promote pre-adipocyte growth and development.     

重组脂联素对皖南花猪脂肪细胞脂联素及其受体mRNA表达的影响

脂联素（Adp）是主要由脂肪组织分泌的细胞因子,有重要的生理作用。本试验旨在研究重组脂联素（rAdp）对皖南花猪脂肪细胞脂联素及其受体2,AMP激活蛋白激酶（AMPK）、过氧化物增殖剂活化受体α（PPARα）mR-NA表达的影响。选择10d皖南花猪皮下脂肪组织分离前体脂肪细胞,增殖培养至80%融合后换分化培养基培养,细胞分化后用0、2和10mg/L rAdp分别处理12和48h。油红O染色法鉴定脂肪细胞,MTT方法检测细胞活力;酶法测定培养液中甘油释放量,荧光定量RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素（Adp）、脂联素受体1（AdpR1）、脂联素受体2（AdpR2）、PPARα和AMPK mRNA表达。结果显示,rAdp处理后,脂肪细胞活力总体有降低趋势,10mg/L处理48h达到显著水平（P〈0.05）;rAdp处理对甘油释放的抑制作用未达到差异水平。rAdp处理12h后,脂肪细胞AdpR1和AdpR2mRNA表达显著升高（P〈0.01）,但无剂量依赖性;rAdp处理48h后,脂肪细胞AdpmRNA表达显著下降（P〈0.05）。rAdp处理12h后,脂肪细胞PPARαmRNA表达显著升高（P〈0.01）,且有剂量效应性;而AMP AMPK mRNA表达均无显著性变化。结果提示,重组脂联素处理猪原代脂肪细胞有降低细胞活力和抑制脂肪细胞甘油释放量的趋势,能显著上调AdpR1、AdpR2和PPARα基因的表达,从而刺激脂肪酸氧化和甘油三酯的水解作用。     

新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞原代培养与诱导分化的研究

为建立新西兰兔前体脂肪细胞的体外培养模型,比较新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞分化过程中相关基因的差异表达,实验采集 1 日龄新西兰兔背最长肌和皮下脂肪组织,采用胶原酶消化方法,分别从 2 种组织中分离前体脂肪细胞,进行细胞原代培养,绘制细胞生长曲线,并对肌内和皮下前体脂肪细胞诱导分化,利用 RT-PCR 检测相关基因的表达变化。结果表明:细胞在分离后 2 h 已经贴壁,24 h 时呈现出短梭形的细胞形态,第 2 天细胞变成长梭形,第 3 天进入对数生长期。肌内和皮下前体脂肪细胞在诱导分化后均被油红O 染色,皮下前体脂肪细胞的脂质积累在诱导分化的第 2 天显著高于肌内前体脂肪细胞(P<0.05);荧光定量结果表明,肌内和皮下前体脂肪细胞 CCAAT 增强子结合蛋白(C/EBPα)基因的表达趋势在诱导分化过程中相同,肌内前体脂肪细胞过氧化物酶体增殖激活受体(PPARγ)第 4 天的表达量显著高于第 6 天,而皮下前体脂肪细胞 PPARγ表达量差异不显著;肌内前体脂肪细胞脂蛋白脂肪酶(LPL)表达量在第 0天和第 2天差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2 天显著高于第 0 天(P<0.05);肌内前体脂肪细胞脂肪酸合酶(FAS)基因第 0、2、4 天的表达量差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2、4 天显著高于第 0 天(P<0.05)。本研究成功构建了新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞的体外培养和诱导分化模型,并发现皮下前体脂肪细胞分化早于肌内前体脂肪细胞,为进一步研究新西兰兔前体脂肪细胞的分化机制和脂肪沉积奠定基础。     

维生素D受体在体外培养SD大鼠脂肪细胞中的表达

为了探索维生素D受体(VDR)在SD大鼠脂肪细胞分化过程中的表达规律,采用Ⅱ型胶原酶消化法进行SD大鼠脂肪细胞的分离培养,并将其诱导分化为成熟的脂肪细胞,分别在细胞生长至单层汇合后的第0、4、8、12、16天收集细胞样品。对VDR和脂滴进行荧光染色,同时采用Western blot对脂肪细胞分化过程中的VDR蛋白表达量进行分析,采用real-time PCR定量分析脂肪细胞分化过程中的VDR表达量。结果显示,随SD大鼠脂肪细胞的分化,细胞中脂滴逐渐增加,VDR mRNA和蛋白的表达量与脂质积累过程呈负相关性,表明VDR的表达在脂肪细胞分化过程中有一定的变化规律,其可能以负反馈的调节机制参与了脂肪细胞的分化过程。