细胞生物反应器大规模培养草鱼细胞和病毒

应用细胞生物反应器微载体悬浮培养法,对草鱼胚胎细胞 CP-80 进行大规模培养,同时增殖草鱼出血病病毒。细胞经培养6天后,细胞量可达到8.4×10~6cells/ml,较始接量(2×10~5cells/ml)提高了41倍。接入草鱼出血病病毒后,经5天培养增殖,毒力达到8.0LgTCID_(50)/0.1ml,较始接毒力(3.75LgTCID_(50)/0.1ml)增加了4.25个对数值。     

草鱼_中华鳖淋巴细胞扫描电镜结构_省略_绵羊红细胞受体_CD_2_的检测

草鱼淋巴细胞表面扫描电镜结构特征为有孔穴且较为光滑、具短小细锥状突起;中华鳖淋巴细胞、胸腺细胞表面扫描电镜结构特征为凹凸不平、较为光滑;它们均以表面凹凸不平特征的占大多数。E花环试验的光镜和扫描电镜观察显示：草鱼淋巴细胞E花环形成不明显,而中华鳖淋巴细胞、胸腺细胞的成花率分别为25％－34％和36％－47％,能形成花环的淋巴细胞、胸腺细胞以表面结构特征凹凸不平（类似哺乳动物T淋巴细胞）的为主。草鱼、中华鳖血液淋巴细胞和中华鳖胸腺细胞与抗人CD2单克隆抗体交叉反应的免疫组化检测显示中华鳖血液淋巴细胞和胸腺细胞的CD2阳性率分别为24％和33％。草鱼血液淋巴细胞CD2阳性反应不明显。     

草鱼、中华鳖淋巴细胞扫描电镜结构特征及其绵羊红细胞受体(CD2)的检测

草鱼淋巴细胞表面扫描电镜结构特征为有孔穴且较为光滑、具短小细锥状突起;中华鳖淋巴细胞、胸腺细胞表面扫描电镜结构特征为凹凸不平、较为光滑;它们均以表面凹凸不平特征的占大多数.E花环试验的光镜和扫描电镜观察显示草鱼淋巴细胞E花环形成不明显,而中华鳖淋巴细胞、胸腺细胞的成花率分别为25%～34%和36%～47%,能形成花环的淋巴细胞、胸腺细胞以表面结构特征凹凸不平(类似哺乳动物T淋巴细胞)的为主.草鱼、中华鳖血液淋巴细胞和中华鳖胸腺细胞与抗人CD2单克隆抗体交叉反应的免疫组化检测显示中华鳖血液淋巴细胞和胸腺细胞的CD2阳性率分别为24%和33%.草鱼血液淋巴细胞CD2阳性反应不明显.     

中国对虾上皮样细胞培养研究

１９８９年８月起进行了中国对虾上皮细胞的原代和传代细胞培养。对取自甲壳，步足等部位的对虾上皮组织培养研究，共培养６批，获得传代细胞１１株，其中１株传至２５代，传代细胞形态为梭形和下沉上皮细胞形态相似。生长率测定结果，第４天细胞增殖达高峰，倍增时间为４８．７２ｈ。     

鱼类细胞的旋转管培养法

用圆柱形细胞培养瓶,对草鱼吻端组织ZC—7901细胞适应旋转培养条件进行了研究,测定了细胞接种浓度、旋转速度及细胞生长速度等有关参数。试验表明ZC—7901细胞能适应于旋转培养,适应后的细胞对草鱼出血病病毒仍具有敏感性。     

草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其亚株ZC-7901S1的建立和特性观察

以草鱼吻端组织为材料，经体外培养建立了一个上皮样细胞和梭形细胞混合的细胞株，后又从中分离出一个上皮样细胞亚株，分别定名为ZC-7901和ZC-7901S1。对两株细胞进行了基本生物学特性的测定，染色体数目和经长期传代后染色体数目稳定性的分析。实验表明，两株细胞为草鱼正常二倍体(2n=48)细胞株。     

草鱼出血病细胞培养灭活疫苗旋转瓶法大规模生产工艺↑（*）

Ｃａｒｅｌ氏瓶静置培养草鱼ＣＩＫ细胞,细胞２～３ｄ内长成单层,细胞单层均匀而稳定;旋转瓶培养,细胞７ｄ左右长成单层,细胞单层面积大,病毒培养产量高。２种方式所培养病毒的ＴＣＩＤ５０／ｍｌ值稳定在６．０左右。０．１％福尔马林４℃条件下灭活病毒材料１７ｄ制备疫苗,疫苗性能稳定,安全性好。疫苗效力检验结果表明,注射免疫１０ｄ和浸泡免疫１０ｄ后,免疫鱼体内血清中和抗体效价分别为１０７．９±１１．０（３）和６８．５±９．９（３）,免疫保护力分别为（７７．１±８．９）％（３）和（７３．９±８．３）％（３）,与对照组相比差异显著。本研究建立了草鱼细胞培养灭活疫苗大规模生产工艺流程,进行了较大规模的疫苗生产和生产性免疫试验,免疫草鱼成活率平均达到８５％以上。     

鱼类胸腺研究进展

胸腺是大多数鱼类最早发育的中枢淋巴器官[1],也是产生功能性Ｔ淋巴细胞的主要免疫器官[2]。在鱼类免疫细胞的发生过程中,胸腺是最先检测到Ｔ细胞的淋巴组织,Ｔ淋巴细胞在胸腺中发育成熟并被运送到头肾、脾等外周免疫器官[1,3]。另外,许多研究表明鱼类的胸腺直接参与机体防御。例如,胸腺存在Ｂ细胞、浆细胞和空斑形成细胞,表明胸腺直接参与了抗体的产生[4],即胸腺参与了体液免疫反应。在虹鳟(Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｋｉｓｓ)的迟缓型超敏性反应中,大胸腺细胞数量急剧增多[5],表明胸腺本身参与了细胞免疫[6]。胸腺切除实验表明,胸腺在…     

中华鳖胚胎细胞体外培养的研究

研究中华鳖胚胎细胞体外培养适宜培养渗透压、培养基和培养温度等条件,并进行传代试验,结果表明,胚胎原代细胞在２５－２８℃,渗透压２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ,ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％小牛血清培养液及无ＣＯ２的条件下,生长良好,７２ｈ长满足 单层,并能顺利传代。细胞动力学试验表明,传代细胞１－３代为适应期、４－６代为旺盛期、７－９代为衰退期。第６代细胞以体组型分析,其染色体为整二倍体,并未发生转化。     

草鱼细胞和病毒的大规模培养研究

本文对草鱼细胞和病毒的两种大规模培养方式进行了研究和比较。静置培养条件下，细胞生长速度快，２—３天内可形成单层，单层均匀而稳定；旋转培养条件下，细胞７天左右长成单层，细胞单层面积大，病毒培养产量高。这两种培养方式所观察到的细胞病变过程及表征基本相同，病毒的ＴＣＩＤ５０／ｍｌ值稳定在６．０左右。采用这两种培养方式，可实现草鱼细胞和病毒的大规模培养。     

中草药提取物黄连素对草鱼肝细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

本研究运用细胞生物学研究方法,探讨中草药提取物黄连素对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞(L8824)活力、氧化应激和细胞凋亡的影响。用不同浓度黄连素(0μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)分别处理体外培养的草鱼肝细胞Oh、6 h、12 h和24 h,采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示,黄连素浓度和时间对细胞活力有显著交互作用(P0.05),且黄连素浓度对其活力影响差异显著(P0.05),草鱼肝细胞活力随着黄连素的浓度增加先升高后降低(P0.05)。在此基础上,设置了黄连素梯度浓度(0μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)培养草鱼肝细胞12 h后,收集细胞,测定细胞谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT)活性,丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)含量、细胞凋亡水平和相关基因mRNA表达量。结果表明,与不添加黄连素组相比,当黄连素浓度为100μmol/L时,细胞GOT和GPT活性、ROS和MDA含量显著(P0.05)增加。当黄连素的浓度为25μmol/L和50μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P0.05)升高;当黄连素的浓度增加到100μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P0.05)降低。当黄连素的浓度为50μmol/L和100μmol/L时,细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达量显著(P0.05)升高。综上所述,当黄连素浓度超过50μmol/L会抑制细胞的生长,引发氧化应激,影响细胞功能。因此,黄连素在草鱼肝细胞培养液中添加的适宜浓度为25～50μmol/L。     

条斑紫菜丝状体悬浮培养研究

通过光强、光时的实验、比较了在悬浮培养条件下，光对条斑紫菜丝状体生长的影响，探讨并初步确定了丝状藻丝悬浮培养适宜的光强，光时条件。与此同时，还比较了悬浮培养和静置培养的实验结果。显示前者的丝状藻丝有比后者高得多的生长率，更适合于生产性应用。     

鳗鲡冠状病毒样病毒的细胞分离与培养

实验选用４种鱼类传代细胞,对首次发现的鳗鲡“狂游病”的病原－鳗鲡冠状病毒样病毒进行了细胞分离与培养。本研究在鲤上皮乳头状瘤细胞中复制了鳗鲡冠状病毒样病毒粒子,并经病毒细胞培养物的电镜负染和超薄切片法检查得到了证实。     

微载体规模化培养草鱼细胞与病毒的工艺及优化

研究了在悬浮培养系统中使用微载体Cephodex规模化培养草鱼肾脏组织细胞CIK和草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的条件并进行了优化。结果表明,Cephodex是一种适合CIK细胞贴壁生长的微载体,搅拌方式(搅拌时间/静止时间)及血清浓度(0%、5%、10%、15%)对CIK细胞在Cephodex微载体上的贴附效率有影响。贴附期以转速35 r/min、每静置45 min搅拌2 min的间歇搅拌方式最佳,8 h后细胞贴附率可达90%以上;细胞贴附期培养基中的血清浓度为5%。当Cephodex微载体用量10 mg/mL、细胞初始接种密度2.5×105cells/mL、连续搅拌速度40 r/min时可获得最佳的细胞生长效能。用优化的最佳工艺条件大规模培养CIK细胞,接种感染复数为0.1的GCRV病毒3 d后,培养细胞出现典型细胞病变效应,病毒滴度(lgTCID50/mL)为8.5。本项研究为草鱼出血病疫苗规模化制备技术研究奠定了基础。     

桑沟湾海水中浮颗粒物的动态变化

用常规调查分析结合自动监测法对桑沟湾海水中悬浮颗粒物的季节性变化、水平与垂直分布作了全面的调查。结果表明，该湾总悬浮颗粒物和有机悬浮颗粒物的月平均数量变动范围分别为４．６２￣４０．０６和１．９０￣６．１４ｍｇ／Ｌ；叶绿素ａ和悬浮颗粒物的质量变动范围分别为０．９５￣９．６８μｇ／Ｌ和０．０７￣０．８０μｇ／ｍｇ。悬浮颗粒物质量的周日变化与潮流运动有关；而其数量无明显的周日变化。悬浮颗粒物质量的水平分     

鱼类外周血淋巴细胞的分离技术

通过对分离草鱼（ Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌａ） 外周血淋巴细胞技术的探索,发现用相对体积质量为１ ．０８０ ～１ ．０８５ 的Ｆｉｃｏｌｌ－ Ｕｒｏｇｒａｆｉｎ 分层液可将草鱼外周血中淋巴细胞１００ ％ 地分离出来,这对进一步研究鱼类淋巴细胞的结构、功能具有重要意义。同时测得草鱼各类血细胞的相对体积质量：淋巴细胞为１ ．０７７ ±０ ．００２ ,粒细胞为１ ．０９６ ±０ ．００３ ,红细胞为１ ．１１１ ±０ ．００２ 。     

草鱼呼肠孤病毒减毒的研究

草鱼呼肠孤病毒GCHV－892野毒株在PSF细胞中连续传代时，于培养液中加入一定浓度的桉液，传至19代已达减毒目的。继代至29代，其减毒效果保持稳定；传至27代后不再加入桉液，传代至37代，其减毒效果仍保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好，免疫原性强。用该弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后，草鱼的成活率和免疫保护率均达100％。因而作者认为桉液是草鱼呼肠孤病毒的一种良好减毒剂。经桉液减毒的GCHAV－892是一株可应用于生产上制备弱毒疫苗的良好弱毒株。     

鲫、草鱼外周血中淋巴细胞和单核细胞对鲤血管内皮细胞的粘附

借鉴哺乳动物内皮细胞体外培养技术，结合鱼类细胞自身特点，纯化培养鲤血管内皮细胞并传至3代，以此作为粘附材料。应用淋巴细胞分离液离心技术并结合玻璃粘附法分离纯化鲫、草鱼外周血中淋巴细胞、单核细胞，并与上述3代内皮细胞进行免疫粘附试验，同时进行免疫粘附动力学观察。结果显示，鲫、草鱼两类细胞对内皮细胞的粘附率分别为0.09±0.013，0.20±0.018；0.11±0.015，0.21±0.023。表明鲤科鱼类不同种的同类细胞粘附率差异不大，而同种不同类细胞则差异显著。动力学观察分析表明，淋巴细胞粘附较快，60min进入平台期；单核细胞粘附慢，120min进入平台期。初步证明鱼类内皮细胞具有免疫介导作用。     

桑沟湾海水中悬浮颗粒物的动态变化

用常规调查分析结合自动监测法对桑沟湾海水中悬浮颗粒物的季节性变化、水平与垂直分布作了全面的调查。结果表明，该湾总悬浮颗粒物和有机悬浮颗粒物的月平均数量变动范围分别为４．６２～４０．０６和１．９０～６．１４ｍｇ／Ｌ；叶绿．素α和悬浮颗粒物的质量变动范围分别为０．９５～９．６８μｇ／Ｌ和０．０７～０．８０μｇ／ｍｇ。悬浮颗粒物质量的周日变化与潮流运动有关；而其数量无明显的周日变化。悬浮颗粒物质量的水平分布趋势为从湾口到湾底逐渐增加；数量的水平分布趋势与之相反。悬浮颗粒物数量的垂直分布趋势为从上到下逐渐升高；质量垂直分布趋势与之相反。在扇贝养殖区内由于扇贝的消耗，中层水中悬浮颗粒物的数量与质量最小。     

用电融合结合继代移核方法构建草鱼抗病体细胞工程鱼

选择对草鱼出血病病毒不敏感的草鱼肝细胞进行细胞培养，建立了草鱼肝细胞株，命名为ＧＬＡ。对ＧＬＡ进行攻毒，发现其对ＦＲＶ有抗性。采用电融合结合继代移核的方法，将ＧＬＡ细胞，移植于草鱼未受精卵内，获得开口前的幼鱼８尾和存活仔鱼１尾，说明此方法能提高细胞的发育功能。